【案例】

使用雙酶切的方式將一段基因序列插入pDsRed2-N1質(zhì)粒中，使其能夠與DsRED蛋白進(jìn)行融合表達(dá)。

【1. 序列導(dǎo)入】

pDsRed2-N1質(zhì)粒可以直接在SnapGene的序列庫(kù)中找到，導(dǎo)入方式在前面的文章中已經(jīng)介紹，這里不再贅述。從圖譜中選擇多克隆位點(diǎn)區(qū)域MCS，點(diǎn)擊，并轉(zhuǎn)到序列頁(yè)面：

同時(shí)，新建DNA序列，將目的基因的序列粘貼進(jìn)去，用于后續(xù)的酶切位點(diǎn)分析。

敲黑板?。?！

【2.?酶切位點(diǎn)分析】

雙酶切連接的酶需要滿足以下要求：

一、酶切位點(diǎn)需要存在于MCS中，但同時(shí)不能存在于目的基因序列中。

二、兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間至少要有幾個(gè)堿基間隔，不能緊鄰或重疊。

三、最好選擇成熟的內(nèi)切酶。

四、結(jié)合實(shí)驗(yàn)室酶庫(kù)，最好保證內(nèi)切酶能在同一最佳緩沖液進(jìn)行反應(yīng)

五、雙酶切后末端不會(huì)發(fā)生自連

按照以上原則，我們先看基因中的常見酶切位點(diǎn)：

然后在MCS中排除這些酶切位點(diǎn)：

之后在剩下的酶切位點(diǎn)中，選擇常用的即可，因?yàn)镠indIII、EcoRI兩個(gè)酶切位點(diǎn)靠的太近，沒有選擇這兩個(gè)的組合，以免造成雙酶切的效率下降。因此，最終選擇的是EcoRI+KpnI的酶切組合。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)EcoRI酶和KpnI酶的最佳NEB反應(yīng)緩沖液不一樣，查看EcoRI酶和KpnI酶的TAKARA雙酶切體系，推薦使用TAKARA的M緩沖液。

【3. 調(diào)整融合表達(dá)的閱讀框】

因?yàn)槟康幕蛐枰诤舷掠蔚臒晒獾鞍走M(jìn)行示蹤，所以調(diào)整閱讀框的通順性是非常重要的，首先將目的基因中的終止密碼子去除，然后將載體上EcoRI+KpnI之間的序列替換為去除終止密碼子之后的目的基因的序列：

觀察目的基因向下游表達(dá)至DsRed2中的氨基酸序列（HGL），發(fā)現(xiàn)與DsRed2原始序列（MAS）不同，即發(fā)生了移碼，完整的閱讀框遭到了破壞。因此，我們需要在目的基因下游與KpnI之間添加堿基恢復(fù)其閱讀框的正確。

從上圖中可以看出，當(dāng)添加了兩個(gè)堿基之后，之前的兩個(gè)不同的氨基酸序列合二為一，變?yōu)檎_的序列，即目的Gene可以跟下游的DsRed2基因進(jìn)行正確的融合表達(dá)了。(如果您的蛋白序列3端不是核心功能區(qū)，去掉一個(gè)堿基同樣可以修復(fù)閱讀框)