成纖維細(xì)胞由功能不同的細(xì)胞群體組成，這些群體根據(jù)其來源的組織和與之相關(guān)的疾病而不同。此外，即使在一個組織中，也不是所有的成纖維細(xì)胞都是一樣的。離散的、不重疊的成纖維細(xì)胞亞型驅(qū)動著這些細(xì)胞的許多生物學(xué)功能的不同方面。在一項新的研究中，美國研究人員構(gòu)建出不同組織中的成纖維細(xì)胞基因表達(dá)的比較圖譜，揭示了同一器官內(nèi)和不同器官的成纖維細(xì)胞譜系的一般組織原則（organizing principle）。這項研究表明，成纖維細(xì)胞存在通用的（universal）、特化的（specialized）和疾病特異性的（perturbatione-specific）亞群，并指出這三種亞型有一個共同的祖先。

這篇文章的分析做的實在是太好了，以至于我覺得一樣的idea，一樣的數(shù)據(jù)，我都分析不出這樣的結(jié)果，佩服。

成纖維細(xì)胞遍布所有組織，通過產(chǎn)生和重塑細(xì)胞外基質(zhì)蛋白 (ECM) 來塑造器官的形態(tài)，長期以來，從同一組織或不同組織中分離出來的成纖維細(xì)胞之間的家族關(guān)系一直是個謎。原因之一是，在出現(xiàn)對單細(xì)胞中的RNA進(jìn)行分析的方法之前，很難將成纖維細(xì)胞分為不同的亞型。所有成纖維細(xì)胞都執(zhí)行與其譜系相一致的類似功能，如制造和修改細(xì)胞外基質(zhì)的分子。然而，它們也可以執(zhí)行專門的程序，以適應(yīng)它們所居住的特定組織的需求。例如，特化的成纖維細(xì)胞支持骨髓中造血（血液和免疫）細(xì)胞的發(fā)育。成纖維細(xì)胞如何實現(xiàn)通用和特化的功能一直不清楚。
造血細(xì)胞，如免疫系統(tǒng)的巨噬細(xì)胞，通過采用共享的、全譜系的、核心的基因表達(dá)模式，然后輔以微環(huán)境線索驅(qū)動的組織特異性基因表達(dá)，解決了具有通用功能和特化功能的問題。巨噬細(xì)胞由一種稱為單核細(xì)胞的細(xì)胞類型補(bǔ)充。單核細(xì)胞在血液中循環(huán)，并作為組織巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的通用庫。到目前為止，尚未解答的問題是，成纖維細(xì)胞是否遵循這種巨噬細(xì)胞的方法，或者在一個特定的組織中，成纖維細(xì)胞是否存在另一種情況，即一個“通用的”、泛組織的成纖維細(xì)胞前體細(xì)胞亞群與這些細(xì)胞的一個更成熟的、組織特異性的亞群一起存在。
既往的單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 研究一定程度上揭示了組織內(nèi)成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性¹，揭示了組織內(nèi)成纖維細(xì)胞具有的臨床意義（成纖維細(xì)胞的亞型可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、癌癥和纖維化適應(yīng)癥如特發(fā)性肺纖維化 (IPF) 中的疾?。?。新的證據(jù)表明，組織內(nèi)的成纖維細(xì)胞亞型參與調(diào)控組織穩(wěn)態(tài)和疾病的不同方面。了解不同條件下成纖維細(xì)胞表型是環(huán)境依賴的還是保守的可能會為疾病治療提供新的線索。我們假設(shè)穩(wěn)態(tài)下的組織類型差異和特定的疾病背景共同引起了成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性。

1. Fibroblasts in steady-state mouse tissues

Fig 1A：為了解決這個問題，這些作者首先整合了正常狀態(tài)的16個臟器/組織的28個單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中的PDGFRa⁺成纖維細(xì)胞。

PDGFRa：成纖維細(xì)胞標(biāo)志物

Fig 1B：得到120583個細(xì)胞，分為10個亞群。網(wǎng)站：https://www.fibroxplorer.com
Fig 1C：展示了每個群的差異基因，細(xì)胞群的功能和所在的組織。可以看到Pi16⁺和Col15a1⁺在所有組織中都存在，這表明這兩個細(xì)胞群可能代表了泛組織成纖維細(xì)胞。其余八個亞群則主要在不同的特定組織中存在。

既往文獻(xiàn)報道過的亞群和該數(shù)據(jù)集中的亞群對應(yīng)
Ccl19⁺ fibroblastic reticular cells (FRCs) ,
Coch⁺ red pulp fibroblasts,
Cxcl12⁺ mesenchymal stromal cells and osteolineage cells,
Fbln1⁺ and Bmp4⁺ intestinal fibroblasts,
Comp⁺ fibroblasts,
Npnt⁺ alveolar fibroblasts
Hhip⁺ peribronchial fibroblasts

Fig 1D：Slingshot擬時序的結(jié)果提示Pi16⁺成纖維細(xì)胞是分化起點(diǎn)，其先分化成Col15a1⁺成纖維，隨后分化成多種不同的成纖維細(xì)胞。
這些結(jié)果提示了通用的（universal）和特化的（specialized）成纖維細(xì)胞的存在，而且它們之間存在分化關(guān)系。通用成纖維細(xì)胞的作用包括分泌ECM，其中 Col15a1⁺ 通用成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出分泌基底膜蛋白的能力，可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)。而位于血管附近的Pi16細(xì)胞可能作為組織成纖維細(xì)胞起源的儲存細(xì)胞。

2. Dpt^IRESCreERT2 mouse validates scRNA-seq

隨后作者通過流式檢測了Pi16⁺ (LY6C⁺SCA1⁺)和Col15a1⁺ (LY6C^?SCA1⁺) universal fibroblasts，以及specialized fibroblasts (LY6C^?SCA1^?)，結(jié)果顯示PDGFRα ⁺成纖維細(xì)胞在11個組織中都可以分為3群。This approach confirmed the existence of bona fide universal and specialized phenotypes.

為了驗證這一假設(shè)，這些作者著手尋找可用于識別Pi16和Col15a1成纖維細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物。研究顯示存在一組基因，其表達(dá)與成纖維細(xì)胞的特化成相反關(guān)系：在Pi16成纖維細(xì)胞中高度富集，在Col15a1成纖維細(xì)胞中則較低程度富集。在這些基因中，他們著重研究了Dpt，它是Pi16和Col15a1通用成纖維細(xì)胞的一種潛在的標(biāo)志物。

隨后作者構(gòu)建了表達(dá)Dpt編碼蛋白的熒光鼠，通過新下面的策略可以造成Dpt表達(dá)的細(xì)胞同時表達(dá)YFP，隨后可以通過熒光篩選出Dpt+的細(xì)胞或進(jìn)行示蹤。
參考：Cre小鼠的簡介與應(yīng)用

YFP在正常的細(xì)胞里面由于前面表達(dá)了stop元件是不能表達(dá)的，但是現(xiàn)在Cre通過IRES元件與Dpt共表達(dá)，有Dpt的，就會有Cre；有了Cre，就可以剪切stop，使得YFP表達(dá)。(LSL是指Lox-stop-Lox盒結(jié)構(gòu))

Fig 2A：Dpt^IRESCreERT2Rosa26^LSLYFP小鼠被給予含tamoxifen飲食14天。在11個被檢測組織中，PDGFRα⁺成纖維細(xì)胞都顯著表達(dá)YFP。(這張圖是live, EpCAM^?CD45^?CD31^?PDPN⁺PDGFRα⁺的胰腺成纖維，其他組織的圖在附件。Red: Dpt^{IRESCreERT2ki/ki}Rosa26^{LSLYFPwt/loxP}; Grey: Dpt^{IRESCreERT2wt/wt}Rosa26^{LSLYFPwt/loxP})
Fig 2B：不同臟器中的重組效率不同，淋巴結(jié)顯示出最低比例的 YFP⁺成纖維 (28.7 ± 5.5% (mean ± s.e.m.)) ，心臟最高 (83.7 ± 3.1%)。

正常狀態(tài)下心臟里的成纖維絕大多數(shù)都是通用成纖維
（但是文章里都沒有鑒定出心臟specialized和perturbatione-specific的成纖維細(xì)胞）

Fig 2C-D：The distinction between universal and specialized fibroblasts was also observed at the protein level via YFP expression in Ccl19^YFP and Gremlin1^CreERT2Rosa26^LSLYFP mice. （用了兩種特化成纖維細(xì)胞的示蹤鼠）
C圖展示了Ccl19^YFP小鼠淋巴結(jié)的Pi16⁺ (LY6C⁺SCA1⁺)和Col15a1⁺ (LY6C^?SCA1⁺) universal fibroblasts，以及specialized fibroblasts (LY6C^?SCA1^?)細(xì)胞中YFP的表達(dá)，D圖展示了Grem1^CreERT2wt/kiRosa26^{LSLYFPwt/loxP}小鼠三種細(xì)胞中YFP的表達(dá)。
Fig 2E：Dpt^IresCreERT2Rosa26^LSLYFP小鼠淋巴結(jié)，肺和其他組織中YFP的表達(dá)趨勢則和前面相反。

3. Fibroblasts in perturbed mouse tissues

為了探究perturbed狀態(tài)下的成纖維異質(zhì)性，作者隨后對感染，損傷，腫瘤，纖維化，代謝改變和關(guān)節(jié)炎情況下的成纖維數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。
Fig 3A：整合了來自17個數(shù)據(jù)集13個組織成纖維細(xì)胞，得到了PDGFRa⁺的perturbed-state fibroblast atlas。
Fig 3B-C：聚類得到10個cluster： Pi16⁺ , Col15a1⁺ , Ccl19⁺ , Cxcl12⁺ , Comp⁺ , Npnt⁺ , Hhip⁺ , Adamdec1⁺ , Cxcl5⁺和Lrrc15⁺。

> Pi16⁺ 和Col15a1⁺這兩個群高表達(dá)Dpt，屬于通用成纖維細(xì)胞
> Ccl19⁺ , Cxcl12⁺ , Comp⁺ , Npnt⁺ , Hhip⁺ 這幾群則和正常組織中同名的特化細(xì)胞群在基因表達(dá)和組織分布上都很相似。
> Adamdec1⁺ , Cxcl5⁺和Lrrc15⁺這幾群則似乎代表了在正常狀態(tài)中不存在的perturbation-specific活化的成纖維細(xì)胞。

^{??三群細(xì)胞中只有Lrrc15+是表達(dá)Acta2的肌成纖維細(xì)胞，其他兩群只是活化的成纖維，不是肌成纖維細(xì)胞。}

Cxcl5⁺群主要存在于early muscle injury，并高表達(dá)趨化因子如Ccl2和Ccl7。Adamdec1⁺群則主要存在于colitis，并高表達(dá)Il11和Grem1。Lrrc15⁺細(xì)胞群則存在于arthritis, skin wound, fibrosis和small and large pancreatic ductal adenocarcinoma等疾病，這群細(xì)胞還高表達(dá)Cthrc1, Acta2, Postn和Adam12以及膠原，提示這群細(xì)胞代表myofibroblasts。
Fig 3D：作者隨后探究了universal fibroblasts是否是 LRRC15⁺ myofibroblasts的起源。作者使用了Dpt^IresCreERT2;Rosa26^LSLYFP小鼠的皮下腫瘤模型，發(fā)現(xiàn)Dpt^{IresCreERT2ki/ki}小鼠中，52 ± 7%的LRRC15⁺ myofibroblasts是YFP陽性的。提示表達(dá)在腫瘤發(fā)生前標(biāo)記的Dpt的通用成纖維細(xì)胞在腫瘤狀態(tài)下可以分化為LRRC15⁺myofibroblasts。

4. Single-cell RNA-seq of human fibroblasts

最后作者在人的組織上驗證了前面的結(jié)果
Extended Data Fig. 9A-C：作者對3例胰腺癌患者的癌和癌旁組織進(jìn)行了單細(xì)胞測序，得到21262個細(xì)胞，鑒定出了C3和C8這兩群成纖維細(xì)胞。C3是腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)，C8則是正常成纖維。
Extended Data Fig. 9D-E：為了探究C8是否代表著人通用成纖維細(xì)胞，作者將C8的20 most upregulated定義為人通用成纖維表達(dá)模塊，并使用GTEx數(shù)據(jù)庫推斷了不同組織中這些細(xì)胞的豐度。
Extended Data Fig. 9F-G：結(jié)果顯示在包括正常胰腺的12種人類組織中都發(fā)現(xiàn)了人通用成纖維表達(dá)模塊基因的強(qiáng)共表達(dá)(r > 0.5)
Extended Data Fig. 9H-I：在單細(xì)胞水平，人通用成纖維表達(dá)模塊基因在胰腺和脂肪組織中被觀察到。

Extended Data Fig. 9

Extended Data Fig. 10A：隨后作者比較了C3和C8的差異基因，使用C3的上調(diào)基因作為human fibroblast activation program。
Extended Data Fig. 10B：universal和activated gene programs之間存在強(qiáng)負(fù)相關(guān) (r = ?0.54)。提示人成纖維細(xì)胞的活化可能與通用成纖維細(xì)胞的基因表達(dá)丟失有關(guān)。和小鼠中觀測到的相一致。

Extended Data Fig. 10

Fig 4A：最后作者通過整合c3 PDAC CAFs, colitis患者的結(jié)腸成纖維細(xì)胞核IPF，非小細(xì)胞肺癌和新冠患者的肺成纖維細(xì)胞， 構(gòu)建了human perturbed-state atlas。
Fig 4B-C：一共得到了10,355個細(xì)胞，分為6個細(xì)胞群。這些群中包括一個PI16⁺細(xì)胞群，代表了人類通用成纖維細(xì)胞群；主要存在于肺臟疾病中的NPNT⁺肺泡成纖維細(xì)胞；主要存在于結(jié)腸癌患者中的ADAMDEC1⁺和CCL19⁺細(xì)胞群；還有兩群LRRC15⁺和COL3A1⁺肌成纖維細(xì)胞。
Fig 4D：LRRC15⁺肌成纖維細(xì)胞在胰腺癌和肺癌中比較多，COL3A1⁺肌成纖維細(xì)胞則主要存在于肺癌。

人類擾動狀態(tài)成纖維圖譜從各個方面驗證了小鼠擾動狀態(tài)圖譜，包括 LRRC15⁺ 肌成纖維細(xì)胞和 ADAMDEC1⁺ 成纖維細(xì)胞，但也表明在人適應(yīng)癥特異性刺激下或不同信號持續(xù)時間可能會驅(qū)動未在小鼠中看到的額外肌成纖維細(xì)胞群類型。

Discussion

這些作者的這項具有里程碑意義的研究具有深遠(yuǎn)的意義。它確定了健康和疾病中成纖維細(xì)胞譜系的關(guān)鍵組織原則。雖然巨噬細(xì)胞與成纖維細(xì)胞一樣，是在組織中尋找危險信號的哨兵細(xì)胞，但是與巨噬細(xì)胞不同的是，成纖維細(xì)胞譜系可分為三種主要亞型：通用的亞群和特化的（穩(wěn)態(tài)的）亞群，以及激活的（擾動狀態(tài)的）亞群，所有這些亞型可共同存在于同一組織中。小鼠中的某些成纖維細(xì)胞和人類中的某些成纖維細(xì)胞之間的一致性特別有意義，因為它表明小鼠中的機(jī)理研究可能與人類疾病有直接關(guān)系。此外，這項研究提供了一個資源，將有助于澄清術(shù)語，提高對不同組織的特定成纖維細(xì)胞亞型的識別精度。為了使目前在臨床研究中作為細(xì)胞療法修復(fù)組織的成纖維細(xì)胞亞群標(biāo)準(zhǔn)化，迫切需要這樣的研究進(jìn)展。
這些發(fā)現(xiàn)最令人興奮的意義也許在于，觀察到特定組織中存在非重疊的疾病相關(guān)的成纖維細(xì)胞亞群，而且這些細(xì)胞與參與健康組織修復(fù)和組織特化的其他亞型不同，這可能會帶來臨床益處。如果能夠靶向這些致病的成纖維細(xì)胞亞群，而不影響與健康相關(guān)的成纖維細(xì)胞亞群，那么就有可能以更有針對性和更少免疫抑制的方式治療某些炎癥和惡性疾病。能夠靶向有害的成纖維細(xì)胞而不影響有益的成纖維細(xì)胞和造血細(xì)胞，將徹底改變許多慢性疾病的治療。

Limitations：

同期nature評論

Reference:

1. Koliaraki, V., Prados, A., Armaka, M. & Kollias, G. The mesenchymal context in inflammation, immunity and cancer. Nat. Immunol. 21, 974–982 (2020).