哺乳動(dòng)物的肝臟是維持代謝穩(wěn)態(tài)及解毒的重要器官，單細(xì)胞 RNA 測(cè)序技術(shù)可以鑒定到大多數(shù)肝細(xì)胞類型，但如何獲取細(xì)胞類型在組織上的定位及其基因表達(dá)情況，并研究細(xì)胞間相互作用及通訊對(duì)于增強(qiáng)我們對(duì)肝臟發(fā)育及疾病發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的了解至關(guān)重要。
10x 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)結(jié)合顯微成像、靶向探針捕獲、芯片、測(cè)序技術(shù)，從一片完整的冰凍組織切片或石蠟組織切片中獲取切片不同位置細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并將組織學(xué)和基因表達(dá)分析相結(jié)合。
接下來，我們將總結(jié)一下空間轉(zhuǎn)錄組發(fā)表的關(guān)于肝臟的文章
案例一
單細(xì)胞結(jié)合空間組學(xué)解析胎肝造血干細(xì)胞擴(kuò)增功能單元
【發(fā)表期刊】Cell Research
【影響因子】25.617
【發(fā)表時(shí)間】2021. 08
【發(fā)表單位】中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院
【實(shí)驗(yàn)技術(shù)】10x?單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組，10x?空間轉(zhuǎn)錄組
PART.1
研究背景
造血干細(xì)胞是血液的源頭，具有強(qiáng)大的自我更新和多向分化能力，是惡性血液疾病移植治療的重要細(xì)胞來源，但是，造血干細(xì)胞來源不足卻是限制其推廣的瓶頸。在哺乳動(dòng)物的發(fā)育過程中，胎兒肝臟是各種來源的造血細(xì)胞（HCs）進(jìn)行成熟、擴(kuò)增和分化的場(chǎng)所，因此全面、系統(tǒng)、立體化地解析這一擴(kuò)增性造血器官，將為體外擴(kuò)增造血干細(xì)胞提供理論指導(dǎo)。
PART.2
研究思路
PART.3
主要研究結(jié)論
01、繪制了胎肝血細(xì)胞和微環(huán)境細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組圖譜，解析了造血干/祖細(xì)胞和微環(huán)境細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)變化。通過對(duì)造血干/祖細(xì)胞的異質(zhì)性進(jìn)行深入解析，發(fā)現(xiàn) CD93 可以富集干性較強(qiáng)的造血干/祖細(xì)胞。
02、單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合繪制單細(xì)胞空間圖譜，驗(yàn)證了 HSCs / MPPs 與微環(huán)境細(xì)胞間的相互作用，鑒定了干細(xì)胞擴(kuò)增功能單元。
03、功能試驗(yàn)驗(yàn)證巨噬細(xì)胞和生態(tài)微環(huán)境細(xì)胞促進(jìn) HSCs / MPPs 擴(kuò)增的機(jī)制。
04、跨物種分析發(fā)現(xiàn)人和小鼠之間具有保守的造血干/祖細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)構(gòu)和機(jī)制，但也存在物種對(duì)外界刺激適應(yīng)性反應(yīng)特異性機(jī)制。
案例二
利用10x Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)綜合分析原發(fā)性肝癌空間結(jié)構(gòu)
【發(fā)表期刊】SCIENCE ADVANCES
【影響因子】14.136
【發(fā)表時(shí)間】2021. 11
【發(fā)表單位】上海東方肝膽外科醫(yī)院
【實(shí)驗(yàn)技術(shù)】10x?空間轉(zhuǎn)錄組
PART.1
研究背景
原發(fā)性肝癌是死亡率第二高的腫瘤,其中，肝細(xì)胞性肝癌（HCC）和肝內(nèi)膽管癌（ICC）是兩種主要的組織學(xué)亞型。到目前為止，治療原發(fā)性肝癌的有效非手術(shù)治療策略還很少，而且缺乏有效的藥物治療靶點(diǎn)。有單細(xì)胞研究表明一些特異的 T 細(xì)胞在 HCC 中顯著富集，腫瘤異質(zhì)性及其在肝癌診斷中的臨床意義已有多方面的研究，但是對(duì)肝癌腫瘤空間結(jié)構(gòu)的研究還是空白。海軍軍醫(yī)大學(xué)國(guó)家肝癌科學(xué)中心王紅陽院士、陳磊研究員團(tuán)隊(duì)聯(lián)合清華大學(xué)古槿教授團(tuán)隊(duì)利用 10X Genomics 高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)進(jìn)行了原發(fā)性肝癌邊界區(qū)和腫瘤內(nèi)空間異質(zhì)性研究，成功繪制了原發(fā)性肝癌高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組圖譜。
PART.2
研究思路
PART.3
主要研究結(jié)論
01、利用空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)構(gòu)建了原發(fā)性肝癌的高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，原發(fā)性肝癌的組織內(nèi)部細(xì)胞亞群具有區(qū)域分布和交錯(cuò)分布兩種模式，來自相同類型區(qū)域的細(xì)胞簇總體上更相似。
02、腫瘤邊緣區(qū)域微環(huán)境特征：腫瘤包膜可能影響腫瘤內(nèi)空間簇的連續(xù)性、轉(zhuǎn)錄組多樣性和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)，原發(fā)性肝癌邊界區(qū)域腫瘤纖維包膜的完整性與腫瘤細(xì)胞的空間異質(zhì)性及其周圍基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的分布密切相關(guān)。主要由成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成的完整纖維包膜可以作為阻止免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的屏障。
03、原發(fā)性肝癌腫瘤內(nèi)部的異質(zhì)性：瘤內(nèi)空間異質(zhì)性廣泛存在。腫瘤內(nèi)部不同細(xì)胞亞群具有不同優(yōu)勢(shì)基因表達(dá)、細(xì)胞功能、預(yù)后以及克隆來源。且腫瘤內(nèi)部細(xì)胞亞群并不獨(dú)立，在彼此接觸的范圍（100μm 寬交界區(qū)）會(huì)發(fā)生廣泛的配體-受體相互作用，不同細(xì)胞簇間的相互作用可能有助于研究腫瘤生態(tài)系統(tǒng)和進(jìn)化。
04、三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLS）的空間分布及臨床特征：通過與 H&E 染色相結(jié)合分析，HCC-5 樣本的 cluster6 被鑒定為 TLS 區(qū)域。選擇 cluster6 中高特異性表達(dá)的前50個(gè)基因（TLS-50）作為特征基因， TLS-50 可以識(shí)別信號(hào)噪聲比更高的 TLS 區(qū)域。
案例三
利用10x Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)綜合分析原發(fā)性肝癌空間結(jié)構(gòu)
【發(fā)表期刊】Nature Communication
【影響因子】14.919
【發(fā)表時(shí)間】2021. 11
【發(fā)表單位】斯德哥爾摩大學(xué)
【實(shí)驗(yàn)技術(shù)】ST空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)?
PART.1
研究背景
哺乳動(dòng)物的肝臟是維持代謝穩(wěn)態(tài)及解毒的重要器官，肝臟中約80%的細(xì)胞都是實(shí)質(zhì)細(xì)胞即肝細(xì)胞，剩余的細(xì)胞被劃分為非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPCs），這些細(xì)胞共同組成了肝小葉功能環(huán)境。單細(xì)胞空間重建的研究中發(fā)現(xiàn)，肝臟中的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞也根據(jù)其位置及沿小葉軸存在著差異的基因表達(dá)譜。這些重建的方法，給出了肝小葉微環(huán)境中復(fù)雜的代謝分區(qū)，鑒定了沿小葉軸的差異表達(dá)基因，并為肝分區(qū)研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。然而基于顯微切割等的方法需要對(duì)組織進(jìn)行解離，也從一定程度上破壞了肝臟的基因表達(dá)。作者利用 ST 技術(shù)繪制了小鼠肝臟分區(qū)基因表達(dá)模式和結(jié)構(gòu)組分。
PART.2
研究思路
PART.3
主要研究結(jié)論
01、空間轉(zhuǎn)錄組聚類定義肝組織中的基因表達(dá)模式：組織覆蓋的 spot 可聚成6個(gè)不同的 cluster，不同細(xì)胞類型的 marker 基因在所有 spot 中表達(dá)的頻率與這些細(xì)胞在肝組織中的比例趨向一致。高豐度或更大的細(xì)胞在肝組織中更廣泛地分布，而稀有的細(xì)胞或體積較小的細(xì)胞的分布則較為稀疏。
02、結(jié)合門靜脈和中央靜脈來判斷基因的表達(dá)模式，建立了二元線性模型。該模型可以對(duì)基于經(jīng)驗(yàn)的組織學(xué)注釋進(jìn)行補(bǔ)充，尤其對(duì)于難以分辨的結(jié)構(gòu)成分。
03、探索了肝組織異質(zhì)性的相關(guān)組分，cluster5 在整個(gè)組織切片中呈現(xiàn)多個(gè)區(qū)域的零星分布特征，根據(jù)其基因表達(dá)情況，cluster5 中標(biāo)記基因的通路分析表明這些基因富集在膠原和纖維組織相關(guān)途徑上，表明 cluster5 在空間組織上是一個(gè)獨(dú)立于肝功能分區(qū)的結(jié)構(gòu)。
案例四
利用10x Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)綜合分析原發(fā)性肝癌空間結(jié)構(gòu)
【發(fā)表期刊】Cell
【影響因子】41.582
【發(fā)表時(shí)間】2022. 1.20
【發(fā)表單位】比利時(shí)根特大學(xué)等
【實(shí)驗(yàn)技術(shù)】單細(xì)胞?CITE-seq、單核測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和空間蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)
PART.1
研究背景
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的巨大技術(shù)進(jìn)步使人們能夠更好地了解跨物種不同器官的細(xì)胞組成，但了解這些細(xì)胞在組織中的基因表達(dá)信息及其與周邊細(xì)胞的相互作用對(duì)于研究器官發(fā)育及疾病的發(fā)生、發(fā)展、治療具有重要的意義。文中，作者運(yùn)用單細(xì)胞核測(cè)序，單細(xì)胞測(cè)序，空間轉(zhuǎn)錄組和空間蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等研究了小鼠和人類健康肝臟的細(xì)胞類型及特定的空間位置，確定了健康肝臟中不同肝巨噬細(xì)胞表型的保守空間相關(guān)信號(hào)。
PART.2
研究思路
PART.3
主要研究結(jié)論
01、小鼠肝臟的蛋白質(zhì)基因組圖譜：?jiǎn)魏?RNA 測(cè)序（snRNA-seq）和單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（scRNA-seq）都可以檢測(cè)不同的細(xì)胞組成，其中 snRNA-seq 能重現(xiàn)檢測(cè)到的細(xì)胞頻率。CITE-seq 分析，利用差異表達(dá)的基因（DEGs）和蛋白質(zhì)（DEPs）確定了17種細(xì)胞類型。確定了所有細(xì)胞的表面標(biāo)志物，包括 Kupffer 細(xì)胞（KCs）的 VSIG4FOLR2。
02、空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)果確定了肝巨噬細(xì)胞包括 Kupffer 細(xì)胞、非 Kupffer 細(xì)胞等細(xì)胞亞群，各亞群功能各異且存在于不同的生態(tài)位中。對(duì)非 Kupffer 細(xì)胞的分析發(fā)現(xiàn)，cluster8 細(xì)胞簇類似于 Gpnmb+Spp1+ 脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞（LAMs），位于膽管周圍。
03、人類肝臟的巨噬細(xì)胞分為10個(gè) cluster，cluster10 是真正的人類 Kupffer 細(xì)胞。物種間轉(zhuǎn)錄組的重疊可能是由于核心 Kupffer 細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的保守表達(dá)。
04、配體受體分析結(jié)果表明進(jìn)化上保守的 ALK1-BMP9/10 軸對(duì)于肝臟中 Kupffer 細(xì)胞的存在至關(guān)重要。
