蛋白純化后續(xù)的問題分析

1.目的蛋白純化濃縮之后，目的蛋白條帶周圍出現(xiàn)雜帶，據(jù)推測可能是插入目的基因后，外源基因的表達刺激大腸桿菌產(chǎn)生了宿主蛋白酶，對異源蛋白進行降解的產(chǎn)物。

緩沖液如何選擇

用 Tris-HCl 還是 PB，選擇的依據(jù)是蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和活力在哪個緩沖液中好，濃度一般 50mM，但是緩沖液應與

樣品緩沖液有相同的 pH 和離子強度。

洗脫采用的離子強度的大小范圍應該如何確定

離子交換純化是利用離子交換劑上的可解離基團(活性基團)對各種離子的親和力不一樣達到分離目的的一種蛋白純化分離技術(shù),離子強度越大，洗脫越好。具體的離子濃度范圍可以很大，0.01mol/l 到 1mol/l，甚至 3.0mol/l，PH值的范圍液很廣。主要根據(jù)你的蛋白質(zhì)的等電點。

蛋白掛在陽離子交換柱上洗脫不下來

1. 蛋白與離子柱得結(jié)合太強，換弱陽的瓊脂糖凝膠介質(zhì)，比如由 sp 的換成 CM

2. 減少離子柱與樣品的結(jié)合時間，防止蛋白沉在柱上。

3. 若洗不下來的是雜蛋白直接用 0.1M 氫氧化鈉洗。

標簽蛋白易洗脫

1. 離子交換每個梯度都洗下來目標蛋白，最大可能性是上樣量過大，流速太大，建議增加清洗的體積數(shù)，減

少上樣量，降低上樣速度。

2. 上樣完洗脫前，清洗的不徹底。

3. 標簽沒有表達出來：1. 可能是因為折疊構(gòu)象不正確導致標簽在重折疊時沒有位于蛋白質(zhì)分子的表面上無法與離子柱結(jié)合。2. 標簽在折疊時沒有位于蛋白質(zhì)分子的表面上。

4. 填料有問題，換填料。

5. PH、離子強度是否合適，平衡緩沖液是否應與樣品緩沖液 pH、離子強度相同。

標簽包涵體蛋白易洗脫

1. 蛋白質(zhì)的折疊形態(tài)發(fā)生了改變隱藏了標簽，而使得蛋白質(zhì)無法掛柱。

1. 因臨近的空間的一個或多個氨基酸的空間位阻阻礙了標簽與離子柱形成共價鍵。

2. 環(huán)境影響：pH，離子強度，其他蛋白質(zhì)分子，緩沖溶液類型，有關(guān)影響蛋白質(zhì)分子表面的試劑等。增加所提的蛋白質(zhì)樣品的溶解度或還可以加大離子型、非離子型或兩性離子表面活性劑的濃度或類型。

2. 柱子沒平衡好，平衡緩沖液沒加咪唑，平衡液 PH 不適合，緩沖液 pH 要與蛋白質(zhì) pI +/-1-2。

3. 有比鄰的組氨酸的污染蛋白質(zhì)與離子柱結(jié)合，通過降低洗脫液 pH 值使得標簽質(zhì)子化而使得污染蛋白質(zhì)從

層析住上被洗脫。

4. 一些蛋白質(zhì)或 DNA 與帶有標簽的目的蛋白發(fā)生了非特異性相互作用， 可以用低濃度的去污劑 （2%的 Triton

X-100 或濃度不大于 0.5%SDS)洗滌樣品 （上樣洗脫時） 或增加洗脫液的鹽濃度 （氯化鈉溶液低于 2mol/L） 。

5. 填料有問題，換填料。

6. 最后可以考慮一下試劑的問題。

目的蛋白先洗脫雜蛋白被吸附

1. 更換緩沖液，可能 pH 與蛋白質(zhì) pI 較接近。

2. 填料選擇不對，與蛋白結(jié)合力太弱，更換適合改純化蛋白質(zhì)的填料。

3. 直接收取目的蛋白，再用其他純化方法進一步純化。

蛋白純化出現(xiàn)沉淀

1. pH 發(fā)生變化，導致蛋白質(zhì)沉淀。找準蛋白質(zhì)的一個等電點，溶液環(huán)境的ph值不能在蛋白質(zhì)等電點的附近，如果在等電點的附近的時候，這個時候蛋白非常容易沉淀?？筛鶕?jù)軟件計算入VECTOR NTI計算其理論等電點，盡量純化的溶劑在遠離等電點。

2. 離子溶度過高，緩沖液的離子溶度降低。人為配制的溶液環(huán)境，不一定真正符合蛋白本身的“生存”的環(huán)境要求，所以要從離子濃度和pH去考慮，特別是鹽離子濃度；所謂的鹽濃度，就是鹽析效應。高濃度的鹽破壞蛋白的水化層，使得蛋白質(zhì)聚集沉淀。常用的就是硫酸銨沉淀。鹽析沉淀通常對蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)沒有破壞，再溶時活性可以完全恢復。常見的例子就是硫酸銨沉淀純化IgG。同樣，硫酸銨沉淀也常碰到不可逆的情況。例如大腸桿菌(Escherichia coli)表達的重組蛋白往往在硫酸銨沉淀后再溶困難。

3.在Ni純化的過程中，有一部分鎳離子會脫落，脫落的鎳離子屬于重金屬，會對蛋白的凝集和沉積起到一定的作用。

4.蛋白反復凍溶，過程中生成的一些小冰晶會對這個蛋白的結(jié)構(gòu)造成一定的傷害，離子和緩沖液狀態(tài)發(fā)生較大變化；

5.如果長時間放在4度的情況之下蛋白質(zhì)，容易滋生微生物，微生物的生長的可能造成蛋白的性質(zhì)變化或者降解也容易產(chǎn)生一些聚集沉淀；

如何避免和解決重組蛋白純化后聚集沉淀呢？

1.我們建議如果用鎳柱來純化蛋白的時候，純化的過程純化之后的溶液當中適當?shù)募右稽cEDTA，讓它螯合脫落下來的鎳離子，減少重金屬對蛋白的傷害；

2.我們可以加點分散劑，避免蛋白質(zhì)分子接觸碰撞，減少它的聚集，這些分散劑，比如說甘油，聚乙二醇，甘露醇，還有這個山梨醇之類的

3.我這個蛋白的話允許你加入一些輔助性的保護蛋白的話，那是最好比如說這個白蛋白，

4.可以加一點個氨基酸，比如說精氨酸

5.準確的算出蛋白質(zhì)的pI等電點，算等電點是要把整個蛋白包括融合的部分都代入計算，包括載體上的人和蛋白，所以這樣才能算出一個準確的等電點，溶液的環(huán)境的pH值，要避免在等電點附近.

6.一個蛋白有些蛋白比較嬌貴，有些蛋白比較皮實，在這過程中的話，我們還要避免蛋白的一些熱損傷

7.很多的蛋白的話，它獨立的時候是很難存在的，它必須有一些輔助的離子或者輔助的一些蛋白，它才能夠一個很好的維持一個很好的一個構(gòu)象，所以必要的時候添加它的一些輔助的蛋白或者是因子

8.每個蛋白的情況都不一樣，也許你在處理其他蛋白的時候都很好，但是處理這個蛋白的時候情況完全不一樣，這就是為什么呢？我們研究的這些蛋白，有時候沒有一招鮮或者是通用方案；我們曾遇過這樣的一個案例，某個寄生蟲體內(nèi)的一個酶，我們表達的時候，它可以得到上清表達非常好，我們對其中的一個氨基酸進行突變，它立馬從上清表達狀態(tài)變到包涵體表達狀態(tài)；從這個地方我們是否可以通過加減氨基酸為蛋白質(zhì)”改命“（改性）。

9.若發(fā)生不可逆沉淀，可以選擇離心，過濾等方式去除。

注意事項

1. 倒入速度不要太快，以防產(chǎn)生泡沫和氣泡。

2. 裝柱的注意事項:

1. 裝柱時應注意液面不能低于樹脂表面。

2. 樹脂懸浮液的溫度要相對恒定或與室溫接近，否則柱床體內(nèi)易產(chǎn)生氣泡而影響分離效果。

3. 裝好的柱體應該沒有“紋路”、節(jié)痕和氣泡，并且柱床體表面平整而均勻。否則需要重新裝柱。

4. 在裝柱的同時應該將其他儀器設(shè)備（如：恒流泵等）電源接通，并按實驗要求進行預熱和調(diào)試。需

將恒流泵流速調(diào)至 0.4ml/min。

3. 應將洗脫液放至液面與樹脂相切時再上樣，且樣品一旦加入就應該立即開始收集流出液。 （第一管，應在

4ml 處做一標記）。?

4. 加樣時要沿柱內(nèi)壁緩慢地加入柱中，以免沖壞樹脂表面，以及在柱內(nèi)形成氣泡，影響分離效果。