文章題目：Small RNA deep sequencing reveals the expressions of microRNAs in ovine mammary gland development at peaklactation and during the non-lactating period

發(fā)表期刊：Genomics

技術(shù)手段：Small RNA測(cè)序

派森諾生物與甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)攜手合作，于近期在《Genomics》上發(fā)表了Small RNA深度測(cè)序揭示綿羊泌乳高峰期和空杯期乳腺發(fā)育中的microRNA表達(dá)相關(guān)研究成果。

研究背景

小尾寒羊是一種廣泛分布于我國(guó)北方和中部地區(qū)的高繁殖力綿羊品種，平均產(chǎn)羔率為280％。然而，小尾寒羊的低成活率已成為限制農(nóng)民商業(yè)收益的重要因素之一。研究表明，母羊的產(chǎn)奶量會(huì)通過(guò)影響羔羊的發(fā)育和生長(zhǎng)速度而影響羔羊成活率。因此，闡明小尾寒羊的乳腺發(fā)育和泌乳分子機(jī)制具有重要經(jīng)濟(jì)作用。

MicroRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度約20-24個(gè)核苷酸的非編碼小RNA分子。在動(dòng)物中，通過(guò)與其靶基因的3'-UTR 結(jié)合而影響目標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性及翻譯，最終在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究表明，miRNA是影響乳腺發(fā)育、泌乳及其與乳房相關(guān)疾病的關(guān)鍵調(diào)控因子。迄今為止，miRNA在家畜乳腺組織中表達(dá)的研究主要集中在奶牛、山羊、水牛和豬中，而在綿羊中研究很少。

因此，在本研究中，使用小RNA測(cè)序技術(shù)研究了泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺組織中miRNA表達(dá)譜，確定了一些差異表達(dá)miRNA及其與乳腺發(fā)育和泌乳相關(guān)的靶基因和KEGG途徑，使我們對(duì)miRNA在綿羊乳腺中的作用有了更深層次的了解。

研究方法

樣本：泌乳高峰期的小尾寒羊乳腺組織、空杯期的小尾寒羊乳腺組織

實(shí)驗(yàn)方法：Small RNA測(cè)序

測(cè)序平臺(tái)：illumina Hiseq

技術(shù)路線圖見(jiàn)下

研究結(jié)果

1、小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)匯總

對(duì)來(lái)自泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺組織的6個(gè)樣品進(jìn)行小RNA測(cè)序。數(shù)據(jù)質(zhì)量合格后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行小RNA序列的長(zhǎng)度和豐度統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖1所示：泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺組織中的小RNA長(zhǎng)度分布是相似的。大多數(shù)小RNA的長(zhǎng)度分布在18-24 nt的范圍內(nèi)，其中長(zhǎng)度為22 nt的MicroRNA（miRNA）最多，分別在泌乳高峰期和空杯期綿羊乳腺組織中占34.28％和27.00％。其次是長(zhǎng)度為21 nt（泌乳高峰期綿羊乳腺組織中占8.44％，空杯期綿羊乳腺組織中占13.25％）和23 nt長(zhǎng)度（泌乳高峰綿羊乳腺組織中占8.43％，空杯期綿羊乳腺組織中占9.63％）的miRNA。

圖1?小尾寒羊泌乳高峰期和空杯期乳腺組織中小RNA的長(zhǎng)度分布及豐度

2、已知和新的miRNA的鑒定

通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)和預(yù)測(cè)，對(duì)小RNA進(jìn)行分類注釋，注釋結(jié)果如圖2所示：以miRNA數(shù)量最多（包括已知的miRNA和新的miRNA），分別在泌乳高峰期和空杯期綿羊乳腺組織中占89.90％和88.04％。

圖2?小RNA在綿羊乳腺中的分布

（a）泌乳高峰期綿羊峰乳腺中的小RNA類型 ?（b）空杯期綿羊乳腺中的小RNA類型

接下來(lái)分析已知miRNAs的表達(dá)水平，空杯期的綿羊乳腺組織以miR-143，miR-21，miR-26a，miR-99a，miR-148a，let-7i，let-7g和let-7f的豐度最高（圖3）。然而，在泌乳高峰期綿羊乳腺組織中豐度最高的是miRNA是miR-148a，miR-143，miR-26a，let-7f，let-7g，miR-30a-5p，let-7a和miR-21（圖3）。

圖3?空杯期綿羊乳腺組織（a）和泌乳高峰期綿羊乳腺組織（b）中鑒定出的八個(gè)表達(dá)最高的miRNA

3、泌乳高峰期和空杯期綿羊乳腺組織間的差異表達(dá)miRNA

對(duì)已知miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，結(jié)果顯示（表1）：在泌乳高峰期和空杯期綿羊乳腺組織中共鑒定出23條差異表達(dá)的miRNA。相對(duì)于泌乳高峰期的綿羊乳腺組織，有八種miRNA在空杯期綿羊乳腺組織中表現(xiàn)出更高的表達(dá)量，其中差異表達(dá)上調(diào)最高的是miR-199a-3p，其次是miR-221、miR-125b、miR-329b-3p和miR-493-5p。相對(duì)于泌乳高峰期的綿羊乳腺組織，有15種miRNA在空杯期綿羊乳腺組織中表現(xiàn)出更低的表達(dá)水平。其中差異表達(dá)下調(diào)最低的是miR-148a，其次是miR-30a-5p、miR-200c、miR-200a和miR-200b。

表1泌乳高峰期和空杯期綿羊乳腺組織間的差異表達(dá)miRNA

4、差異表達(dá)miRNA的靶基因預(yù)測(cè)和KEGG通路分析

采用miRanda和TargetScan預(yù)測(cè)了差異表達(dá)miRNA的靶基因，總共鑒定出13082個(gè)靶基因。選擇差異表達(dá)miRNA中表達(dá)最顯著的十個(gè)miRNA（非泌乳期綿羊乳腺組織中上調(diào)和下調(diào)表達(dá)最顯著的miRNA各五個(gè)）以及相應(yīng)的靶mRNA構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)（圖4）。

圖4?差異表達(dá)miRNA的miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)及其靶基因

注：紅色代表在空杯期中上調(diào)的miRNA，綠色箭頭代表在空杯期中下調(diào)的miRNA（相對(duì)于泌乳高峰期乳腺組織）；灰色圓圈代表預(yù)測(cè)的miRNA的靶基因

基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異表達(dá)miRNA的靶基因進(jìn)行KEGG富集分析。分析結(jié)果顯示：在空杯期中上調(diào)表達(dá)的差異miRNA的靶基因涉及24條代謝通路。圖5展示了富集程度最顯著的前十五條代謝途徑。其中富集程度最高的是溶酶體通路，招募了18個(gè)靶基因。其次是Wnt信號(hào)通路、 MAPK信號(hào)通路、GPI-錨定蛋白生物合成通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路和FoxO信號(hào)通路，分別招募了16、21、7、17和14個(gè)靶基因。

對(duì)于在空杯期中下調(diào)表達(dá)的差異miRNA，其靶基因富集于21條代謝途徑上。其中富集最顯著的途徑是PI3K-Akt信號(hào)通路 ，招募了33個(gè)靶基因。其次是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路、軸突引導(dǎo)通路，血小板活化通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控通路和溶酶體通路，分別招募的靶基因數(shù)量為22、22、18、21和18個(gè)（圖5）。

圖5泌乳高峰期和空杯期綿羊差異表達(dá)miRNA的靶基因KEGG富集分析

（a）與高峰期相比，在空杯期綿羊乳腺組織中差異上調(diào)miRNA的靶基因KEGG富集分析 ????????

（b）與高峰期相比，在空杯期綿羊乳腺組織中差異下調(diào)miRNA的靶基因KEGG富集分析

注：x軸表示-log10（p-value），x軸表示該途徑中募集的差異表達(dá)miRNA的靶基因數(shù)目

5、RT-qPCR驗(yàn)證差異表達(dá)miRNA

選擇十六個(gè)差異表達(dá)的miRNA，通過(guò)RT-qPCR驗(yàn)證miRNA測(cè)序結(jié)果的可靠性。分析結(jié)果如圖6所示：miR-200b、miR-103、miR-107、miR-148a、miR-30b、miR-30d、miR-200a、let-7b、miR-30a-3p和miR-30a-5p在空杯期綿羊乳腺組織中的表達(dá)比在泌乳高峰期中低。然而，miR-125b、miR-493-5p、miR-432、miR-199a-3p、miR-221和miR-329b-3p在空杯期綿羊乳腺組織中的表達(dá)比在泌乳高峰期中高。RT-qPCR結(jié)果表明，差異表達(dá)miRNA的表達(dá)趨勢(shì)與miRNA測(cè)序結(jié)果相一致，證實(shí)了miRNA測(cè)序方法的可靠性和可重復(fù)性（結(jié)合結(jié)果3看）。

圖6?RT-qPCR驗(yàn)證16個(gè)差異表達(dá)miRNA

注：數(shù)據(jù)顯示三個(gè)重復(fù)的平均值±SD；誤差棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差

總 結(jié)

這項(xiàng)研究通過(guò)對(duì)泌乳高峰期和空杯期的小尾寒羊乳腺組織進(jìn)行小RNA測(cè)序，研究miRNA在這兩個(gè)泌乳時(shí)期中miRNA表達(dá)情況。篩選到了一些差異表達(dá)的miRNA，及其與乳腺發(fā)育和泌乳相關(guān)的靶基因和重要的KEGG途徑(溶酶體通路、Wnt信號(hào)通路、 MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路等)。使人們對(duì)miRNA在綿羊乳腺中的作用有了更進(jìn)一步的了解。