本期解讀文獻(xiàn) 內(nèi)容“ 在含氧量正常的情況下，三陰乳腺癌的LncRNA LINK-A激活HIF1α信號通路 ”
一、調(diào)控通路
LncRNA LINK-A在細(xì)胞質(zhì)中與蛋白BRK、LRRK2結(jié)合，當(dāng)有胞外因子刺激時，LINK-A與蛋白復(fù)合物接收EGFR/GPNMB信號然后與轉(zhuǎn)錄因子HIF1結(jié)合，BRK將HIF1的Tyr 565磷酸化，LRRK2將HIF1的Ser 797磷酸化，HIF1磷酸化后進(jìn)入細(xì)胞核與P300共同作用于癌相關(guān)基因的啟動子促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
二、實(shí)驗(yàn)流程
作者首先通過檢測三陰乳腺癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的LINK-A表達(dá)驗(yàn)證在三陰乳腺癌中LINK-A高表達(dá)確定本文的主角；為了驗(yàn)證LINK-A與蛋白BRK和LRRK2結(jié)合，作者分別進(jìn)行RNA pull-down、RIP、dot-blot驗(yàn)證并找出了與這兩種蛋白結(jié)合的RNA位點(diǎn)；EGFR/GPNMB信號通路的激活：作者分別用RNA pull-down、co-IP、純化標(biāo)簽融合蛋白的co-IP等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了胞外因子HB-EGF刺激信號通路使HIF1磷酸化；用FISH、RIP和胞外激酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證HB-EGF刺激使細(xì)胞中EGFR/GPNMB與LINK-A、BRK/LRRK2互作；用體外激酶實(shí)驗(yàn)和各種WB實(shí)驗(yàn)檢測HIF1的磷酸化位點(diǎn)；作者先用co-IP驗(yàn)證HIF1與P300的互作，再通過對LINK-A進(jìn)行BRK、LRRK2結(jié)合位點(diǎn)的突變檢測HIF1的磷酸化和P300的結(jié)合來說明磷酸化的HIF1與P300互作是通過LINK-A與BRK、LRRK2結(jié)合后介導(dǎo)的；最后作者通過CHIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證磷酸化的HIF1結(jié)合到靶標(biāo)基因啟動子上促進(jìn)基因的表達(dá)。
三、核心FIGURE
Figure1說明的是LINK-A與蛋白BRK和LRRK2結(jié)合，并找到的與蛋白結(jié)合的RNA位點(diǎn)。
A、RNA pull-down，用LncRNALink-A探針釣取細(xì)胞內(nèi)與之結(jié)合的蛋白，聯(lián)用質(zhì)譜分析。
B、RIP實(shí)驗(yàn)，用BRK和LRRK2蛋白抗體釣取與蛋白結(jié)合的RNA，然后進(jìn)行Q-PCR檢測驗(yàn)證Link-A與這兩種蛋白高度結(jié)合。
C-D、RNA pull-down，用LINK-A探針分別與純化的帶FLAG標(biāo)簽融合蛋白BRK和帶MYC標(biāo)簽的融合蛋白LRRK2孵育釣取結(jié)合蛋白，然后進(jìn)行WB檢測表明LINK-A直接與BRK以及LRRK2蛋白結(jié)合。
E、斑點(diǎn)印跡雜交，體外將生物素標(biāo)記的LINK-A與標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合然后進(jìn)行斑點(diǎn)雜交檢測LINK-A與蛋白的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)段。
F、RNA pull-down，用LINK-A全長和去除斑點(diǎn)印跡法檢測到的與蛋白結(jié)合位點(diǎn)的突變探針釣取蛋白，然后進(jìn)行WB驗(yàn)證LINK-A與蛋白的結(jié)合區(qū)段。
Figure2說明的是HB-EGF誘導(dǎo)LINK-A-蛋白復(fù)合體與信號通路蛋白EGFR/GPNMB結(jié)合，并促使HIF1磷酸化。
A、RNApull-down，細(xì)胞經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)后，用LINK-A探針釣取RNA結(jié)合蛋白，然后進(jìn)行質(zhì)譜檢測，表明HB-EGF刺激使LINK-A結(jié)合蛋白GPNMB、BRK、HIF1等。
B、WB，分別用EGFR和GPNMB抗體檢測經(jīng)生長因子處理后的細(xì)胞蛋白，結(jié)果表明HB-EGF處理后，EGFR與GPNMB結(jié)合。
C、Co-IP，用EGFR釣取經(jīng)各種胞外因子處理后細(xì)胞中與之結(jié)合的蛋白，然后進(jìn)行WB檢測，表明經(jīng)HB-EGF處理后，EGFR與GPNMB結(jié)合。
D-E、分別用純化的帶標(biāo)簽融合蛋白EGFR和GPNMB釣取經(jīng)HB-EGF處理后細(xì)胞中的結(jié)合蛋白，然后進(jìn)行WB驗(yàn)證表明EGFR與GPNMB直接結(jié)合。
F、Co-IP，分別用BRK、GPNMB和HIF1蛋白抗體釣取經(jīng)胞外因子處理后細(xì)胞中的結(jié)合蛋白，然后用HIF1磷酸化抗體進(jìn)行WB檢測，結(jié)果表明HB-EGF誘導(dǎo)HIF1磷酸化。
G、體外激酶實(shí)驗(yàn)，表明GPNMB被磷酸化。
H、用純化的GPNMB帶釣取經(jīng)HB-EGF處理后中與之結(jié)合的蛋白，然后進(jìn)行WB檢測，表明HB-EGF處理后BRK與GPNMB結(jié)合并被磷酸化。
Figure3說明的是HB-EGF誘導(dǎo)細(xì)胞EGFR/GPNMB與BRK、LRRK2互作。
A、FISH，分別對LINK-A敲低細(xì)胞經(jīng)HB-EGF處理后的細(xì)胞中EGFR和BRK進(jìn)行定位，表明HB-EGF處理使這兩種代表有互作。
B、LINK-A與蛋白BRF、LRRK2結(jié)合位點(diǎn)信息。
C、RIP，分別用LINK-A全長和去除蛋白結(jié)合位點(diǎn)的探針釣取細(xì)胞中與之結(jié)合的蛋白，然后用磷酸化的蛋白抗體進(jìn)行WB驗(yàn)證，表明GPNMB和BRK磷酸化并驗(yàn)證了B圖所示的結(jié)合位點(diǎn)。
D、FISH，表明HB-EGF處理后的細(xì)胞中EGFR和磷酸化的BRK互作。
E-F、體外激酶實(shí)驗(yàn)。
G、體外RNA-蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，用完整蛋白和去除部分組分的蛋白與LINK-A全長和去除蛋白結(jié)合位點(diǎn)的RNA進(jìn)行結(jié)合實(shí)驗(yàn)。
Figure4說明的是HB-EGF激活信號通路BRK促進(jìn)HIF1 Tyr565位點(diǎn)磷酸化，HIF1 Tyr565的磷酸化使Pro564羥基化。
A、體外激酶實(shí)驗(yàn)，表明HIF1的磷酸化位點(diǎn)為Tyr565和Ser797。
B、體外激酶實(shí)驗(yàn)，BRK促進(jìn)HIF1 Tyr565位點(diǎn)磷酸化。
C、WB檢測HB-EGF誘導(dǎo)各種蛋白磷酸化情況。
D-F、LINK-A敲低后經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)的各種蛋白磷酸化情況。
G、HB-EGF處理細(xì)胞不同時間后檢測HIF1 Tyr565和Ser797位點(diǎn)的磷酸化Pro564羥基化。
H、LINK-A敲低后經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)的HIF1Tyr565和Ser797位點(diǎn)的磷酸化Pro564羥基化。
I、各種蛋白敲低后經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)的HIF1 Tyr565和Ser797位點(diǎn)的磷酸化Pro564羥基
化。
Figure5說明的是LINK-A促進(jìn)HIF1磷酸化，磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子HIF1與P300互作促進(jìn)靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。
A、co-IP，用HIF1抗體釣取LINK-A和LRRK2敲低后經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)細(xì)胞中的結(jié)合蛋白，然后用WB驗(yàn)證，表明磷酸化的HIF1與P300結(jié)合。
B、co-IP，用純化的帶標(biāo)簽融合HIF1和Ser797位點(diǎn)突變的HIF1與細(xì)胞總蛋白孵育，然后用標(biāo)簽抗體釣取結(jié)合蛋白進(jìn)行WB驗(yàn)證，表明Ser797位點(diǎn)突變的HIF1不能與P300結(jié)合。
C、將LINK-A全長和BRK、LRRK2結(jié)合位點(diǎn)突變的表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞，然后檢測經(jīng)HB-EGF誘導(dǎo)后的磷酸化的HIF1，表明LINK-A的BRK、LRRK2結(jié)合位點(diǎn)突變后，HIF1不能磷酸化。
D-E、CHIP-seq，HIF1抗體釣取HB-EGF處理后的細(xì)胞中與之結(jié)合的DNA片段，然后進(jìn)行高通量測序，C為HIF1結(jié)合的DNA富集motif，D為結(jié)合的靶標(biāo)。
F、CHIP-q-pcr，HIF1抗體釣取HB-EGF處理后的細(xì)胞中與之結(jié)合的DNA片段然后進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證，表明HB-EGF促進(jìn)HIF1與靶標(biāo)基因啟動子結(jié)合。
參考文獻(xiàn)：Aifu Lin1,Chunlai Li1, Zhen Xing,et al.The LINK-AlncRNA activates normoxic HIF1α signalling in triple-negative breast cancer［J］.NATURECELL BIOLOGY,2016,10.1038/ncb3295
