大家好，本周給大家分享的是2021年12月份發(fā)表在Current biology上與中國(guó)家馬體型相關(guān)主效基因突變的一篇文章。
文章題目：A single-nucleotide mutation within the TBX3 enhancer increased body size in Chinese horses（TBX3增強(qiáng)子內(nèi)的SNP增加了我國(guó)家馬的體型）
期刊： Current Biology
影響因子： 2020_IF= 10.834; 中科大類(lèi): 生物 1區(qū); JCR分區(qū): Q1
發(fā)文單位：中國(guó)農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 法國(guó)圖盧茲第三大學(xué)等5家單位。
文章作者：中國(guó)農(nóng)科院Xuexue Liu為第一作者，蔣琳研究員為通訊作者。
摘要：中國(guó)矮種馬為我國(guó)西南山區(qū)特有，先前的研究已經(jīng)開(kāi)始揭示西方矮馬和普通馬體型變異的遺傳基礎(chǔ)，發(fā)現(xiàn)HMGA2、LCORL/NCAPG、ZFAT和LASP1這些基因座。同樣的遺傳途徑是否會(huì)導(dǎo)致中國(guó)矮種馬的體型變小目前尚不清楚。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，作者利用中國(guó)187份中國(guó)馬的種質(zhì)資源，分析表明T-box轉(zhuǎn)錄因子3（TBX3）的遺傳變異與體型之間存在高度關(guān)聯(lián)。對(duì)189份中國(guó)矮種馬和574份中國(guó)家馬群體進(jìn)行的精細(xì)定位分析將關(guān)聯(lián)縮小到TBX3上游增強(qiáng)子區(qū)域的一個(gè)A/G SNP（ECA8:20644555）。熒光素酶分析證實(shí)單核苷酸G突變可以上調(diào)TBX3表達(dá)，增強(qiáng)子敲除小鼠的四肢明顯比野生型同窩小鼠短。對(duì)古馬群體DNA數(shù)據(jù)的分析表明，現(xiàn)代家馬中最常見(jiàn)的G等位基因最早出現(xiàn)在約2300年前，此后其頻率不斷上升。這與大約從秦國(guó)時(shí)期由于對(duì)戰(zhàn)馬的需求加速了對(duì)大型中國(guó)家馬選育一致?？偟膩?lái)說(shuō)，這項(xiàng)研究描述了中國(guó)矮種馬體型小背后的遺傳機(jī)制，并揭示了過(guò)去中國(guó)家馬育種家的主要選擇目標(biāo)之一是馬的體型。
主要結(jié)果：
1、中國(guó)家馬和矮種馬之間的選擇信號(hào)和全基因組關(guān)聯(lián)分析
作者使用Fst, 核酸多樣性和XP-EHH三種方法鑒定中國(guó)矮種馬和中國(guó)家馬的正向選擇信號(hào)。作者共鑒定了153個(gè)窗口，包括4.66 Mb和69個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（圖1A）。這些候選區(qū)間在中國(guó)家馬顯示出有限的遺傳多樣性，但在矮種馬上沒(méi)有，這表明中國(guó)家馬受到了正選擇（圖1A）。重要的是, 包含最強(qiáng)選擇信號(hào)的四個(gè)異?；蚪M區(qū)域均包含TBX3（圖1A），并進(jìn)一步細(xì)化為80kb區(qū)域（ECA8:20640000–20740000bp）（圖1B）。另外作者對(duì)152份中國(guó)家馬的體高進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定了兩個(gè)顯著性區(qū)域，包含82個(gè)SNPs（圖1C）。第一個(gè)區(qū)域跨越TBX3/TBX5基因座，第二個(gè)區(qū)域包含HMGA2基因座，這一結(jié)果表明TBX3、TBX5和/或HMGA2可能揭示了中國(guó)矮種馬的遺傳基礎(chǔ)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)伊犁馬的TBX3在胎盤(pán)表達(dá)也比NiQi矮種馬高4.3倍（圖1E），表明TBX3表達(dá)水平與成年馬體高呈正相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)與TBX3區(qū)域中沒(méi)有錯(cuò)義突變以及在中國(guó)家馬的該區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的較低的核苷酸多樣性和Tajima's D統(tǒng)計(jì)一致（圖1B）。這表明TBX3區(qū)域內(nèi)存在的遺傳變異可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，并可能導(dǎo)致中國(guó)家馬和矮種馬的體型差異。作者利用單倍型區(qū)塊分析了該區(qū)域的連鎖不平衡（LD），揭示了包含16個(gè)候選SNP的9個(gè)區(qū)塊（H1-H9）,在H2中包含2個(gè)SNPs （TBX3-EN1和TBX3-EN2）（圖1F）, 表明TBX3-EN1和TBX3-EN2單核苷酸多態(tài)性可能調(diào)節(jié)了TBX3的表達(dá)。
圖1. 全基因組統(tǒng)計(jì)分析。（A）“矮種馬”組和“中國(guó)家馬”組中的選擇信號(hào)分析。Fst分析(x軸)，核酸多樣性比值（y軸），XPEHH分析（顏色）。（B）沿著TBX3區(qū)域基因組掃描。在頂部面板中提供了矮種馬（紅）和中國(guó)家馬（黑色）的核苷酸多樣性值，而Tjjima’ D和Fst值顯示在中間和底部面板中。(C) 中國(guó)矮種馬（N=52）和中國(guó)家馬（N=100）體高性狀的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）的曼哈頓圖。（D）QQ圖。（E）三匹NiQi小馬（灰色）和四匹伊犁馬（黑色）的的胎盤(pán)中TBX3、TBX5和HMGA2的FPKM值。(F) TBX3位點(diǎn)的單倍型區(qū)塊分析。
2、鑒定TBX3致病變異體
卡方檢驗(yàn)證實(shí)了與馬體高的強(qiáng)統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)性，TBX3-EN2（p=2.34e-39）比TBX3-EN1（p=8.18e-29）更強(qiáng)（圖2）。關(guān)聯(lián)模型表明TBX3-EN2（TBX3-EN1）處的變化可以解釋該群體中體高變化（～10 cm）的～20.3%（～15.1%）（圖2A）。在藏馬中發(fā)現(xiàn)了中等等位基因頻率（67.2%–87.5%），顯示了中等的馬的體高（125–135厘米）（圖2A）。這證實(shí)了在該模型中，A變異體可以代表TBX3-EN2的祖先等位基因，并且衍生的G等位基因在中國(guó)家馬中的頻率增加，以響應(yīng)更高體高的選擇。TBX3-EN1的遺傳變異分布表明T等位基因可能存在類(lèi)似的情況。
圖2. 更大馬群的基因分型。TBX3-EN1和TBX3-EN2在總共763份馬的種質(zhì)資源中進(jìn)行基因分型，這些馬包括7個(gè)矮種馬品種（N=189）、1個(gè)普氏馬品種（N=13）和18個(gè)中國(guó)家馬品種（N=561）。（A）TBX3-EN2（ECA8:20644555）位點(diǎn)的等位基因頻率。A等位基因?yàn)樗{(lán)色，G等位基因?yàn)槌壬?B) TBX3-EN1（ECA8:20644525）位點(diǎn)（左y軸）的等位基因頻率。C等位基因?yàn)樗{(lán)色，T等位基因?yàn)槌壬?。TBX3-EN2（p=2.34e-39）和TBX3-EN1（p=8.18e-29）與馬的體高（右y軸）表現(xiàn)出強(qiáng)烈的相關(guān)性，分別解釋了20.27%和15.05%的表型變異。黃色和綠色的條紋代表矮種馬和中國(guó)家馬的品種。
3、重建TBX3-EN1和TBX3-EN2衍生等位基因的頻率軌跡
作者利用了之前發(fā)布的古馬基因組序列進(jìn)一步重建了過(guò)去～6000年中TBX3-EN1和TBX3-EN2衍生等位基因的頻率軌跡。研究發(fā)現(xiàn)在大約2300 年前，大多數(shù)古馬樣本攜帶TBX3-EN2的A等位基因，在此之后，G等位基因頻率穩(wěn)步增加（圖3A和3B）。然而此處重建的等位基因軌跡與死后DNA損傷水平無(wú)關(guān)（圖3B）。作者分析支持了TBX3-EN2 G等位基因和TBX3-EN1 T等位基因的選擇，這兩個(gè)等位基因與都馬體高增加有關(guān)（圖3B）。此外，包含TBX3-EN1和TBX3-EN2的TBX3增強(qiáng)子兩側(cè)10 kb區(qū)域內(nèi)245份古馬的基因分型譜與中國(guó)矮種馬（N=52）中發(fā)現(xiàn)的基因分型譜更接近于中國(guó)家馬（N=100）（圖3C）。現(xiàn)代中國(guó)家馬的特征是有限的序列變異，這與該區(qū)域的正選擇一致。
圖3. 古馬樣本中TBX3-EN2處A/G SNP的等位基因頻率。（A）考古遺址的位置?；疑统壬謩e代表TBX3-EN2位點(diǎn)的A和G等位基因。紅色圓圈顯示了G等位基因~2300 年前在哈薩克斯坦Berel最早出現(xiàn)的時(shí)間。（B）TBX3的等位基因時(shí)間軌跡（TBX3-EN1，ECA8:20644525；TBX3-EN2，ECA8:20644555）。(C) 熱圖總結(jié)了現(xiàn)代和古代馬TBX3基因座上游和下游約10 kb的基因型。紅色、灰色和白色線分別表示純合（AA）、雜合（AG）和純合（GG）基因型。紫色、黃色和綠色豎條分別描繪了古代馬、現(xiàn)代矮種馬和馬。
4、TBX3致病變異體的功能驗(yàn)證
基于古代和現(xiàn)代基因組數(shù)據(jù)的分析支持了TBX3-EN1的T突變和TBX3-EN2的G突變的選擇可能在過(guò)去2300年中增加了中國(guó)馬的體型。HEK293T細(xì)胞中的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)分析表明，攜帶TBX3-EN1和TBX3-EN2（T和G）衍生等位基因的載體與僅攜帶TBX3-EN2衍生等位基因的載體之間的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異（C和G；圖4A）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證TBX3突變的后果，作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了TBX3增強(qiáng)子敲除（KO）小鼠（圖4B）。相對(duì)于WT，TBX3增強(qiáng)子-/-小鼠的TBX3前肢轉(zhuǎn)錄減少了6倍（p=0.004）。在胚胎和2周的腿骨中也檢測(cè)到類(lèi)似的TBX3轉(zhuǎn)錄水平降低（p<0.05）（圖4C）。另外作者在11周和2周的小鼠身上使用micro-CT和X射線成像技術(shù)來(lái)測(cè)量參與肢體形成的所有骨結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度(圖4D-F)。有趣的是，前肢的尺寸縮小比后肢更為明顯，尤其是在2周齡的雌性小鼠中，第三和第四掌指的尺寸縮小幾乎達(dá)到20%（圖4E）。
圖4. 細(xì)胞和小鼠模型的功能驗(yàn)證。（A）雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)。(B) TBX3增強(qiáng)子KO小鼠的構(gòu)建和PCR驗(yàn)證。（C）第0天WT（綠色）、KO+/-（灰色）和KO-/-（黃色）小鼠趾骨中TBX3 mRNA的表達(dá)。（D）小鼠前肢和后肢的X射線圖像。（E）2周齡含TBX3增強(qiáng)子的KO-/-和WT小鼠的掌骨長(zhǎng)度。（F）11周齡含TBX3增強(qiáng)子的KO-/-和WT小鼠的掌骨長(zhǎng)度
作者在這項(xiàng)研究中，使用全基因組序列數(shù)據(jù)來(lái)確定中國(guó)家馬和中國(guó)矮種馬品種之間存在顯著差異的候選區(qū)域?？傊?，該研究表明TBX3的表達(dá)在中國(guó)家馬和矮種馬的體型變異中起著關(guān)鍵作用。
文中所有圖片均來(lái)自A single-nucleotide mutation within the TBX3 enhancer increased body size in Chinese horses
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參考文獻(xiàn)：
Liu X, Zhang Y, Liu W, et al. A single-nucleotide mutation within the TBX3 enhancer increased body size in Chinese horses[J]. Current Biology, 2021.
