Cisplatin resistance-related multi-omics differences and the establishment of machine learning models
順鉑耐藥性相關的多組學差異和機器學習模型的建立
發(fā)表期刊：J Transl Med
發(fā)表日期：2022 Apr 11
DOI:? 10.1186/s12967-022-03372-0
一、背景
????????順鉑是由M. Peyrone在1844年首次合成的，其化學結(jié)構(gòu)在1893年由Alfred Werner首次闡明。然而，該化合物直到20世紀60年代才得到充分的科學調(diào)查，當時羅森伯格發(fā)現(xiàn)它能夠抑制大腸桿菌的細胞分裂，這增加了它用于癌癥化療的可能性。1978年，順鉑成為FDA批準的第一個用于癌癥治療的鉑類化合物，后來它成為最重要的抗癌藥物之一。
????????對于其藥理機制，一般來說，它們會損傷DNA，導致細胞周期停滯和細胞死亡，通常是通過細胞凋亡。然而，副作用和耐藥性是順鉑的兩個固有挑戰(zhàn)，限制了其應用和效果。在許多常見的腫瘤類型中，如NSCLC，基于鉑類的DNA損傷劑的療效是有限的，導致只有約三分之一的患者得到好處。
二、材料與方法
1.數(shù)據(jù)來源
(1)細胞系的詳細信息從Cancer Dependency Map和CCLE下載，包括IC50值、細胞系來源、體細胞突變、mRNA表達、miRNA表達和代謝物
(2)從TCGA中下載了用順鉑治療的肺腺癌患者的信息（TCGA-LUAD），以及他們的基因表達數(shù)據(jù)
(3)NSCLC A549和H358細胞來自美國類型培養(yǎng)集
2.實驗流程
(1)差異分析：對低IC50組和高IC50組之間的體細胞突變、RNA、miRNA和代謝物數(shù)據(jù)進行了差異分析
(2)GO、KEGG和GSVA分析：研究與鉑反應明顯相關的蛋白質(zhì)的生物學意義
(3)模型：根據(jù)LASSO的結(jié)果，采用Logistic回歸、分類和回歸樹（CART）以及C4.5決策樹分類算法，利用發(fā)生率來確定因變量的類別；使用逐步回歸法選擇變量
(4)細胞培養(yǎng)和細胞毒性試驗、RNA干擾、RNA制備和qRT-PCR分析、Western blot分析
(5)單一腫瘤和免疫細胞：使用與先前研究中描述的相同方法來測試順鉑敏感性相關基因
三、實驗結(jié)果
1.順鉑細胞IC50值的分組和概述
????????最終有661個細胞系入選，并有完整的mRNA、microRNA表達和代謝物的數(shù)據(jù)。根據(jù)CCLE數(shù)據(jù)庫給出的反映對化療藥物敏感性的IC50值，即半數(shù)抑制濃度，將它們分為3組。該值越低，敏感性越強。在本研究中，將前1/3（220個）的低IC50值（IC50≤10.4）定義為敏感組，后1/3（220個）的低IC50值（IC50≥26.2）被納入非敏感組（圖1）。
????????顯然，對順鉑的耐藥性在不同的癌癥中是不同的。在Depmap數(shù)據(jù)庫中，作者成功地根據(jù)癌癥來源對不同的腫瘤細胞系進行分類，從而得到相關癌癥的順鉑的平均IC50值。圖S1顯示，有6種癌癥的平均IC50值超過100，包括肺腺癌（LUAD）、間皮瘤（MESO）、甲狀腺癌（THCA）等，這意味著這些類型的癌癥患者對順鉑這種最常見的化療藥物產(chǎn)生耐藥的可能性較大。
2.體細胞突變差異
????????將體細胞突變數(shù)據(jù)與藥物敏感性數(shù)據(jù)相匹配后，研究了低IC50和高IC50組之間體細胞突變特征的差異。如圖2A和B所示，雖然兩個體細胞突變的瀑布圖和這些基因的共存集在一定程度上是相似的，但不難發(fā)現(xiàn)，在順鉑耐藥組（高IC50）中，TP53的突變排在第一位（10%），高于順鉑敏感組（低IC50組）的突變率。正如以前所報道的，TP53突變只出現(xiàn)在順鉑耐藥的腫瘤中，特別是在原發(fā)性縱隔非血清腫瘤中。因此可以得出結(jié)論，TP53突變與順鉑耐藥密切相關。相反，MUT5在低IC50組有較高的突變率。作者還檢查了用"drugInteractions "功能從藥物基因相互作用數(shù)據(jù)庫中編譯的藥物-基因相互作用，大多數(shù)藥物都與TTN和TP53有關，這在兩組細胞中差異較小。
3.不同水平基因功能分析的差異分析
????????為了進一步研究兩組細胞之間的差異，作者從不同層面對兩組細胞系進行了差異性分析。首先，在mRNA水平，發(fā)現(xiàn)1348個mRNA在兩組間有差異表達，其中順鉑耐藥組有1個下調(diào)（SLFN1），35個上調(diào)（TMEM4SB、CLDN3、KLK6、IRF5、ZBTB38等）（圖3A）。同樣，在miRNA水平上，如圖3B所示，發(fā)現(xiàn)80個差異表達的miRNA，11個下調(diào)（miR-194、miR-206、miR-215等），12個上調(diào)（miR-144、miR-16、miR-129-3p等）。然而，對于代謝物，只有15種代謝物，如尿素、絲氨酸、肌肽、N-氨基甲酰-β-丙氨酸、胱硫醚等的表達在兩組之間有明顯的差異（圖3C）。在甲基化方面，沒有一個差異甲基化位點與差異表達的基因密切相關（圖3D）。
????????作者首先根據(jù)CCLE數(shù)據(jù)對之前發(fā)現(xiàn)的1348個差異表達的mRNAs進行了GO分析。基因功能富集分析顯示，20個GO功能組在低IC50組和高IC50組之間表現(xiàn)出明顯的差異，包括肌動蛋白結(jié)合、細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、GTP酶結(jié)合、鳥嘌呤核苷酸交換因子活性等(圖5A)。對于基于這些mRNAs的KEGG（圖5B），兩組之間有10條路徑不同。PI3K-Akt信號通路，差異最明顯，基因比例最高，其次是癌癥中的蛋白多糖，焦點粘附等。 接下來，為了進一步總結(jié)通路和功能的差異，使用GSVA總共總結(jié)出643條基因通路圖（圖5C），其中大部分與耐藥有關，包括瑞金他莫昔芬耐藥、EGFR信號24HR、吉非替尼耐藥、KIM-MIC擴增靶點等。
4.模型構(gòu)建和評估
????????首先，應用glmnet R軟件包，以確定DEGs與IC 50高或低有關。在1348個mRNA中選出6個FOXA2、BATF3、SIX1、HOXA1、ZBTB38、IRF5作為順鉑耐藥性的相關特征（圖4A，B），然后建立相關的logistic模型（圖4C）。
????????接下來獲得了IC50的預測值，階梯函數(shù)被用來實現(xiàn)逐步回歸。從結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，6個變量中有3個通過了顯著性檢驗，成為構(gòu)建模型的相對重要的變量。雖然模型中的每個變量都通過了顯著性檢驗，但有必要確保整個模型是顯著的。因此，對該模型進行了Chi-Squared檢驗。隨著這些變量從第一個到最后一個逐一加入到模型中，模型最終通過了顯著性檢驗，表明由這些變量組成的模型是有意義和正確的。
????????最后，檢驗了這些基因是否不僅與順鉑耐藥性有關，而且與患者的生存期也有聯(lián)系。此外，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，它們的表達水平與不同腫瘤患者的預后有一定關系，包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌等（圖5）。事實上，BATF3、IRF5和ZBTB38也有助于評估乳腺癌和卵巢癌患者的化療反應。
????????同樣地，作者建立了miRNA預測模型。從LASSO回歸中，得出4個重要的miRNA，miR-203、miR-200c、miR-148a和miR-142-5p。經(jīng)過階梯函數(shù)，剩下miR-203和miR-200c，它們都通過了Chi-Squared檢驗的顯著性檢驗，表明由這些變量組成的模型是有意義且正確的。
5.BATF3、IRF5、ZBTB38的表達與A549和H358細胞及腫瘤樣本中順鉑的敏感性有關
????????為了檢驗在細胞水平上BATF3、IRF5、ZBTB38的表達與順鉑敏感性的因果關系，人類癌癥細胞系A549和H358（非小細胞肺癌）中分別轉(zhuǎn)染BATF3靶向、IRF5靶向和ZBTB38靶向的siRNA。所有的siRNA介導的沉默被證明是高效的，并能維持3天或更長時間。與模擬沉默細胞相比，IRF5 和 ZBTB38 沉默細胞對順鉑的敏感性至少降低，而 BATF3 沉默細胞對順鉑的敏感性增加（圖6A, B）。
????????共選取6例接受完全順鉑新輔助化療的食管鱗狀細胞癌（ESCC）患者，其中新輔助化療不敏感（NACT-NON-SEN）腫瘤樣本4例，新輔助化療敏感（NACT-SEN）腫瘤樣本2例（圖7A）。采用RECIST標準評價NACT效應的有效性。同樣，選擇了5名LUAD患者，其中3名是NACT-SEN（3名CR，1名PR），2名是NACT-NON-SEN（圖7B）。
????????在LUAD中，BATF3在NACT-SEN組中顯著下調(diào)，而NRAT-SEN組中IRF5，ZBTB38在惡性上皮細胞簇中的表達顯著高于NACT-NON-SEN組（用EPCAM和SOX4標記（圖7）。在ESCC中，BATF3，IRF5，ZBTB38在LYZ和C1QB標記的9801個惡性細胞中表現(xiàn)出相同的趨勢（圖7C)。
四、結(jié)論
????????體細胞突變、mRNA表達、miRNA表達和代謝物的差異都與順鉑耐藥性有關。作者建立的基于BATF3、IRF5、ZBTB38三個基因表達的模型，可以幫助預測接受鉑類藥物，特別是包括順鉑在內(nèi)的化療藥物的癌癥患者的反應和預后。
