sequence assembly
1. DNA測序技術(shù)
第一代：sanger
第二代：高通量 illumina， 454測序，等
2.5代：lon torrent/proton 測序
第三代：pacbio
2.mate-pair（大長度） 文庫的構(gòu)建
≥2k 片段→加接頭→環(huán)化→打斷→短片段→回收帶標(biāo)記的片段對較短的片段進行測序
3. 各測序平臺特性
Illumina
reads：49-300bp
錯誤率 1%左右，3‘端會高一點
pair-end文庫（170-40kb）
數(shù)據(jù)格式 4行：（fastq）
- reads id，@開頭
- 序列信息，N代表不確定
- 質(zhì)量值的id，一般和 reads 的 id 相同
- 質(zhì)量值的信息（ASCII 碼-64 = 質(zhì)量值）
成對的 reads 對應(yīng)的行號是一樣的。
454
reads：700bp（peak），平均 500
error and indel 錯誤
pair-end 1kb-20kb
數(shù)據(jù)格式：
- 序列信息：fasta格式，> 開頭 id
- 質(zhì)量信息：存放于另一個文件中，> 號開頭，直接用數(shù)值表示
4. 組裝的基本思路
策略1：
分級組裝：人類基因組
缺點：實驗環(huán)節(jié)較慢，需要圖譜，消耗高
優(yōu)點：算法簡單，質(zhì)量高
策略2：
鳥槍法（whole-genome shotgun）：
優(yōu)點：實驗簡單，花費低
缺點：計算能力要求，質(zhì)量低
5. 基本概念
overlap：重合部分
contig：組裝的初級序列
pair-end：中間有未知的區(qū)域
scaffold：
6. 基因組大小的估計
流式細胞儀
Kmer 分析
根據(jù)近源物種估計，得到基礎(chǔ)值，得到一些測序數(shù)據(jù)，利用Kmer估計
1. 泊松分布 poisson distribution
測序深度：基因組中每個堿基被測序的頻率。一般情況下，個體測序：30 層
假設(shè)基因組大小為G，隨機測序，read 的長度為L，當(dāng)生成一個read 的時候，一個固定堿基被測到的概率是 L/G， reads 的總量為n_r.
L/G 非常小，而 n_r 非常大，每個堿基被測到的頻率的期望：
d_n = L/G * n_r
它服從泊松分布（n 很大而 p 很小的二項分布）。
Kmer：固定長度的核苷酸序列，奇數(shù)（避免正反鏈一致，中間的肯定不一樣）
假設(shè)基因組中 K 是獨一無二的，則 G 大小的基因組中的 Kmer 的數(shù)量也為G，reads 的長度為 L，則一個固定的 Kmer 被測到的概率為（L- K + 1）/G（因為L上可以有L-K+1個Kmer）。
L-K+1/G 很小，而 n_r 非常大，每個Kmer被測到的頻率的期望和總個數(shù)：
d_k = (L-K+1)/G * n_r
n_k = (L-K+1) * n_r
可推導(dǎo)出：
G = n_k/d_k
d_n/d_k = L/(L-K+1)
圖片為，reads為100時，Kmer長度為25，在d_n 為 40時， d_k 為30.4。
100/(100-25+1) * 40 = 30.4
基因組大小 G = n_k/d_k
7. Kmer 的其他應(yīng)用
下圖為一個比較簡單的基因組的Kmer分布
下面較復(fù)雜：
最前面：測序錯誤造成。
兩個峰值：一個峰高，一個峰低（高雜合基因組造成，深度正好差一倍）。
尾部：由于重復(fù)片段造成的。
下面：
同樣兩個峰，80處有個小峰，基因組帶有高重復(fù)率，但是雜合度不高。
Kmer在組裝上的應(yīng)用
組裝基于 Kmer 而非 reads
長度為17的Kmer，相鄰有16bp是相同的。
read 上的Kmer數(shù)： L-K+1
8. 基于二代測序結(jié)果的組裝
一些名詞：
Illumina
原理：根據(jù)Kmer（Kmer 圖）
軟件：SOAPdenovo（華大）、velvet ABySS、ALLPATH-LG
以SOAPdenovo為例：
-
構(gòu)建圖（De bruijn graph）
image.png
中間的數(shù)字顯示出現(xiàn)的次數(shù)
image.png - 簡化圖，并獲得contigs
去掉低頻kmer鏈接（測序錯誤造成的）
利用各種方法去掉其他的錯誤
最終使 reads 連接成為 contigs - 將 pair-end mapping 到 contigs 上
a. 將pair-end 定位到 contigs（完整的序列（長于Kmer），存在于reads和contig上）
b. 測序方向的問題。
c. 估計gap的大小，用 N 填充。 - 構(gòu)建 scaffolds
- pair-end 中間 gap 的填充（延伸contig）
a. 利用pair-end 的數(shù)據(jù)
b. 長reads可以跨過洞
sanger/454測序
方法：overlap-layout-consensus
代表軟件：Newber、Celera、Phrap
高雜合基因組
fosmid 文庫 + 鳥槍法（牡蠣為例），花費高，周期長
BAC克隆（華大） + 鳥槍法，花費高，周期長
Ultra-Deep de novo，高深度測序 （下一節(jié)），花費少，效果差，周期短
9. 高深度測序原理及方法
利用Kmer分布圖（峰），識別出 unique Kmer 和 repeat Kmer
10. 影響組裝的因素
1. 測序錯誤
N太多（超過 10%，5%，3%，視數(shù)據(jù)多少而定），去掉
測序質(zhì)量
接頭序列，reads和接頭比對
小的 insert size
去除 PCR duplication
測序錯誤引起的問題
Kmer 峰的前移
糾正
包含錯誤位點的Kmer出現(xiàn)的頻率低，識別出，一次替換為其他三個堿基，直至Kmer的出現(xiàn)頻率變高。
為了不人為改變造成錯誤，一般一個reads只改一個
先糾錯 再進行 contigs 的組裝
2. 重復(fù)序列
N50和N90 推測影響
3. 雜合
N50和N90 推測影響
如果雜合度超過千分之5，就要考慮是否考慮 高深度測序等。
11. 輔助組裝的技術(shù)
- Fosmid-end/ BAC-end
- 遺傳圖譜和物理圖譜
- optical mapping，酶切，獲得片段長度，輔助組裝
- The Irys System (BioNano)，密度高
可以偵測 gap 的大小及錯誤的插入
盡量將組裝結(jié)果，連接到假染色體上。
12. 評價基因組
基于長度
N50：contigs從長到短排序，累加到總長50及以上是，那個conig的長度。
N90：同理
genome 的覆蓋度（80%以上）
基于準(zhǔn)確度
與EST 或 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù) 比對
golden standard （比如 fosmid 等）
同源方法，與同源物種或模式生物比較基因模式
GC 深度和 測序深度的分析
下圖，紅圈部分，可能是y染色體
下圖，紅圈部分，左右兩端的小圈區(qū)域，GC高的部分可能是細菌污染（可以過濾掉相關(guān)reads）
gap 可能的產(chǎn)生原因：repeat 造成的深度高
基因顛倒，證明是否正確
基因結(jié)構(gòu)預(yù)測，與近源物種比較
13 SOAPdenovo 組裝流程
1. 下機數(shù)據(jù)準(zhǔn)備
后有index，用于區(qū)分樣品
質(zhì)量值：Q = -10 log10P，ASCII碼，減64
PE（pair-end） reads：成對的reads（paired-end reads 和 mate-pair reads）
SE（single-end） reads
2. 過濾，數(shù)據(jù)質(zhì)控
Q20，占全部堿基的80以上。
過濾 adaptor：fastq轉(zhuǎn)化為fasta，利用nucmer將接頭序列與reads相比較，過濾掉adaptor（SOAPfilter）
過濾低質(zhì)量的reads：
N 占太多的 過濾掉（10%）
過濾掉 small insert 的 reads
兩端的堿基準(zhǔn)確率可能較低（兩個reads，A,T不相等），可以剪掉
3. 下機數(shù)據(jù)糾錯
KmerFraq_AR_ 軟件
-K 設(shè)置成17，可以估計出小于16G的基因組
關(guān)注最后一個文件，標(biāo)記各種kmer選項。
4. 基因組大小和雜合度的估計
需要軟件
命令：./KmerFreq_AR_v2.0 -k 17 -t 4 -p species fq.lst
5. SOAPdenovo
配制文件，格式在官網(wǎng)上有介紹
avg_ins： 插入片段的長度
reverse_seq：是否環(huán)化，0 或 1
... ...
