ECL Western特異發(fā)光檢測試劑盒用于辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的蛋白或核酸檢測。下面以engreen的超敏型ECL發(fā)光液Enlight-Plus為例，說一下檢測實(shí)驗(yàn)步驟。
1. 常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、HRP 標(biāo)記抗體或核酸探針孵育、洗膜。以下操作在室溫進(jìn)行。
注意：Enlight-Plus 推薦的抗體稀釋度為:
儲存液濃度為1mg/ml 的一抗推薦稀釋度 儲存液濃度為1mg/ml 的二抗推薦稀釋度
1:1000-1:5000 或 0.2-1.0μg/ml 1:2000-1:10,000 或10-50ug/ml
2. 新鮮配制發(fā)光工作液。將BufferA 和Buffer B 按1:1 比率混合，制成發(fā)光工作液(每1cm2膜需要0.125ml 發(fā)光工作液)。轉(zhuǎn)移到清潔的塑料小盒中。
3. 用鑷子將漂洗過的膜取出，將膜的下緣與濾紙輕輕接觸以除去膜上多余的洗液，但勿使膜完全干燥。將膜轉(zhuǎn)移至有發(fā)光工作液的塑料小盒中，使其完全浸泡，輕輕搖晃，室溫孵育幾十秒到1 分鐘。
4. 用鑷子將膜夾起5-10 秒，并將膜的下緣與濾紙輕輕接觸以除去膜上多余的發(fā)光液，迅速將膜完全包裹于潔凈保鮮膜內(nèi)，去除氣泡和褶皺，蛋白面朝上固定于X 片暗盒內(nèi)。
5. 在黑暗中一次重疊放入3 張X 光膠片，30 分鐘或更長時(shí)間后全部取出顯影。
6. 對同一張膜進(jìn)行多次蛋白雜交：用PBST 或TBST 洗滌掉發(fā)光液（10min×3 次），然后從開始一抗雜交即可。
Western-blot中ECL發(fā)光液的選擇很重要，Enlight-Plus檢測級別可達(dá)pg級，發(fā)光時(shí)間長，背景低，得到的圖像很漂亮，非常有利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。
