RIP和RNA pulldown都是研究RNA和蛋白相互作用的經(jīng)典方法，只是出發(fā)點(diǎn)不一樣而已。
RIP，RNA 結(jié)合蛋白便宜共沉淀，是從蛋白出發(fā)研究蛋白R(shí)NA相互作用的技術(shù)。就是已知一個(gè)蛋白，推測(cè)會(huì)與你的目的RNA相互作用，用蛋白的抗體做免疫共沉淀，把蛋白結(jié)合的RNA富集出來并鑒定目的RNA，以證實(shí)蛋白與RNA的相互作用。
RNA pulldown是從RNA出發(fā)研究蛋白與RNA相互作用的技術(shù)。就是用已知的RNA 去拉蛋白，在做western驗(yàn)證以證實(shí)蛋白與RNA的相互作用。
其實(shí)就是要證實(shí)蛋白與RNA兩個(gè)分子相互作用，分別從蛋白和RNA的角度求證。一般兩個(gè)實(shí)驗(yàn)都是陽性才能說明他們相互作用。
近年來lncRNA的研究進(jìn)展迅猛，各類?lncRNA?被大量發(fā)現(xiàn)，lncRNA的研究將是?RNA?基因組研究領(lǐng)域非常熱門的一個(gè)方向。小編也正好也在做lncRNA相關(guān)的課題，今天就總結(jié)一下lncRNA的研究套路和最新研究進(jìn)展。
??LncRNA基本介紹
LncRNA：long non-coding RNAs是一類長(zhǎng)度大于200nt，但不編碼蛋白質(zhì)的RNAs，廣泛存在于動(dòng)植物中。它們?cè)L(zhǎng)期被誤認(rèn)為是遺傳暗物質(zhì)，但近些年研究證實(shí)這類RNAs在生物的生命活動(dòng)過程中起著重要的調(diào)控作用。
特點(diǎn)
1.?長(zhǎng)度在200-100,000nt
2.?沒有編碼蛋白質(zhì)潛能
3.?具有細(xì)胞或組織類型特異性
4.?表達(dá)量和保守性比mRNA低
5.?部分lncRNA不含有polyA尾巴
6.?部分也會(huì)翻譯小肽段
??LncRNA功能及作用形式
功能
1.?結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，干擾其靶基因，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄
2.?作為分子海綿，吸附miRNA
3.?與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，影響蛋白多聚物的形成
4.?招募染色質(zhì)修飾因子，改變?nèi)旧|(zhì)的修飾水平
5.?與mRNA配對(duì)結(jié)合，影響翻譯，剪切，mRNA的穩(wěn)定性(類似miRNA功能)
作用
1.?Co-location，也稱cis作用
2.?共表達(dá),?也稱trans作用
??LncRNA研究基本技術(shù)
1.?芯片或測(cè)序?qū)ふ倚碌膌ncRNA
2.?生物信息學(xué)分析
3.?lncRNA定位
4.?過表達(dá)或敲減功能驗(yàn)證
5.lncRNA互作機(jī)制研究
??LncRNA的生物信息學(xué)分析
1.?基本處理
??rRNA比例評(píng)估
??基本比對(duì)統(tǒng)計(jì)，鏈特異數(shù)據(jù)評(píng)估
??Cufflink,stringtie轉(zhuǎn)錄本組裝
2.?特性分析
??序列，位點(diǎn)保守性分析
??外顯子個(gè)數(shù),表達(dá)和長(zhǎng)度分析
??定量差異分析
3.?新LncRNA鑒定
??與已知lncRNA庫(kù)比對(duì)過濾
??過濾exon<2,長(zhǎng)度<200bp,FPKM<1轉(zhuǎn)錄本
??CPC,CNCI,phyloCSF編碼潛能預(yù)測(cè)
??ORF長(zhǎng)度過濾
??miRNA前體序列過濾
4.?功能分析
??順和反式靶基因預(yù)測(cè)
??靶基因功能富集分析
??共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析
??LncRNA表達(dá)驗(yàn)證
1.?qRT-PCR驗(yàn)證
??cDNA質(zhì)量一定要高，保證沒有基因組DNA的污染
??按變化倍數(shù)排序，優(yōu)先選擇差異變化明顯的lncRNA
??按FPKM或reads count排序，優(yōu)先選擇表達(dá)量高的lncRNA
2.?Northern Blot
??既可以驗(yàn)證lncRNA的表達(dá)豐度又可以驗(yàn)證序列信息，但精度不如qRT-PCR
3.?cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)
??確定lncRNA 5’和3’末端序列，進(jìn)而獲得lncRNA的全長(zhǎng)信息
??LncRNA定位驗(yàn)證
1.?FISH(Fluorescencein Situ Hybridization)驗(yàn)證其亞細(xì)胞定位，因?yàn)槠鋪喖?xì)胞定位與lncRNA的調(diào)控機(jī)制和功能相關(guān)。
2.?對(duì)于已知lncRNA可以通過RNALocate數(shù)據(jù)庫(kù)檢索其亞細(xì)胞定位。
??LncRNA功能驗(yàn)證
1.?功能獲得
構(gòu)建lncRNA過表達(dá)載體，觀察過表達(dá)lncRNA后對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等影響。
2.?功能缺失
根據(jù)其亞細(xì)胞定位選擇合適的敲減方法。有時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的感染效率很高，但是lncRNA的干擾效率卻很低。因?yàn)镽NA干擾作用只作用在胞漿內(nèi)，細(xì)胞核中的lncRNA無法起作用，這時(shí)一般的siRNA或者shRNA方法可能不適用。
3.?其他敲減方法：CRISPR/Cas9、反義寡核苷酸、位點(diǎn)反轉(zhuǎn)和啟動(dòng)子缺失等方法。
??非編碼能力驗(yàn)證
構(gòu)建含有肽段和lncRNA的質(zhì)粒，驗(yàn)證其是否有編碼能力。
??LncRNA互作驗(yàn)證
1.RIP?（蛋白已知，RNA未知）
RIP（RNA immunoprecipitation）又稱為RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)，相當(dāng)于RNA的ChIP實(shí)驗(yàn)（染色質(zhì)免疫沉淀）。
目的：RIP是研究RNA與蛋白相互作用的重要手段，利用RIP可以證明蛋白是否與lncRNA發(fā)生相互作用。
原理：利用目的蛋白結(jié)合RNA形成沉淀復(fù)合物，從沉淀的RNA蛋白復(fù)合物中純化RNA，再進(jìn)行定量或測(cè)序檢測(cè)。
2.RNA-pull down?（RNA已知，蛋白未知）
目的：RNA pull-down實(shí)驗(yàn)主要用來尋找與目的lncRNA結(jié)合的蛋白。
原理：蛋白與生物素標(biāo)記的RNA孵育結(jié)合，富集的蛋白通過SDS-PAGE分離，最后選擇特異性蛋白條帶進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
3. EMSA(RNA已知，蛋白已知)
目的：?RNA EMSA是通過凝膠電泳遷移檢測(cè)蛋白-RNA互作的一種技術(shù)。
原理：標(biāo)記的RNA探針和蛋白孵育，當(dāng)?shù)鞍?RNA復(fù)合體形成后，利用非變性聚丙烯酰胺凝膠分離，來確定RNA結(jié)合蛋白的特異性。
??LncRNA研究最新案例和進(jìn)展
1.?案例-腫瘤
期刊：?Nat Cell Biol (IF=20.06)
Grelet et al. A regulated PNUTS mRNA to lncRNA splice switch mediates EMT and tumour.?Nat Cell Biol. 2017 Sep;19(9):1105-1115.
LncRNA對(duì)腫瘤進(jìn)展的貢獻(xiàn)以及驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的調(diào)控機(jī)制是熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。PNUTS基因的pre-RNA在不同條件下能剪切成兩種產(chǎn)物：lncRNA-PNUTS和正常mRNA-PNUTS,兩種分子在腫瘤中發(fā)揮著不同作用，此研究詳細(xì)的揭示其產(chǎn)生的剪切機(jī)制及兩種分子的功能機(jī)制。
點(diǎn)評(píng)：實(shí)驗(yàn)機(jī)制王道文章
2.?案例-CRISPR-Cas9
期刊：Nature (IF=40.137)
Joung et al. Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood. Nature. 2017 Aug 17;548(7667):343-346
哺乳動(dòng)物基因組包含數(shù)萬個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA的基因座，其中一些已被發(fā)現(xiàn)在生命過程中發(fā)揮重要作用。但確定這些lncRNA的功能和機(jī)制仍具有挑戰(zhàn)性。作者開發(fā)了基于全基因組規(guī)模的CRISPR-Cas9激活篩選系統(tǒng)，可以靶向超過10,000個(gè)lncRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，用于識(shí)別影響感興趣表型的lncRNA?。通過此技術(shù)發(fā)現(xiàn)有11個(gè)lncRNAs在募集活化因子后介導(dǎo)人類黑素瘤細(xì)胞BRAF抑制劑的抗性。
點(diǎn)評(píng)：從組學(xué)高通量篩選到功能高通量篩選的標(biāo)桿文章
3.?案例-單細(xì)胞核測(cè)序
期刊：Nat Commun (IF=12.124)
See K, et al. Single cardiomyocyte nuclear transcriptomes reveal a lincRNA-regulated de-differentiation and cell cycle stress-response in vivo. Nat Commun. 2017 Aug 9;8(1):225
此研究通過對(duì)來自小鼠和人衰竭的心肌細(xì)胞以及正常的成年心臟的單細(xì)胞核RNA測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了心肌細(xì)胞亞群上調(diào)細(xì)胞周期激活等因子并且證明了抑制因子是由體內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)所引起的。通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析來表征這些亞組，并發(fā)現(xiàn)一些起關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的lncRNA。
點(diǎn)評(píng)：?jiǎn)渭?xì)胞測(cè)序技術(shù)和LncRNA研究?jī)蔁狳c(diǎn)結(jié)合文章
希望本篇總結(jié)能給對(duì)lncRNA研究感興趣的小伙伴們一點(diǎn)幫助，同時(shí)如果有l(wèi)ncRNA生信分析或?qū)嶒?yàn)方面的問題，可以通過微信生信草堂交流群進(jìn)行交流哦。
