原代細胞作為直接來源于生物組織的細胞體系，因其較好地保留了體內(nèi)原始的生理特性、遺傳背景及功能狀態(tài)，在基礎(chǔ)研究、疾病模型構(gòu)建及藥物篩選等領(lǐng)域具有不可替代的價值。然而，在原代細胞中進行基因功能研究時，尤其是通過小干擾RNA（siRNA）實現(xiàn)基因沉默，其轉(zhuǎn)染效率往往遠低于永生化細胞系，成為制約實驗成功的關(guān)鍵瓶頸。

本文將系統(tǒng)分析原代細胞難以轉(zhuǎn)染的內(nèi)在原因，評述傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑在原代細胞轉(zhuǎn)染應(yīng)用中的局限性，并重點介紹基于可降解生物納米材料的新型siRNA轉(zhuǎn)染試劑在原代細胞中實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)染的優(yōu)勢，以期為相關(guān)研究提供理想的技術(shù)選擇。

一、原代細胞難以轉(zhuǎn)染的內(nèi)在機制與原因

原代細胞轉(zhuǎn)染困難主要源于其固有的生物學(xué)特性，大體有以下四點：

（1）與經(jīng)過長期體外適應(yīng)、增殖活躍的永生化細胞系不同，原代細胞通常處于有絲分裂不活躍或緩慢的狀態(tài)，這種低增殖率一定程度上限制了其轉(zhuǎn)染效率。

（2）原代細胞對外界刺激非常敏感，其膜結(jié)構(gòu)和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性較差，對傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染過程中引入的物理或化學(xué)擾動耐受性低，易引發(fā)應(yīng)激反應(yīng)甚至凋亡。

（3）原代細胞種類繁多，不同類型細胞在膜組成、電荷特性、內(nèi)吞效率及內(nèi)體逃逸能力等方面存在顯著異質(zhì)性，缺乏一種普適性強的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)染方案。

（4）原代細胞獲取不易、數(shù)量有限且存活時間短，要求轉(zhuǎn)染試劑必須具備高效、低毒的作用特點，這進一步增加了技術(shù)難度。

二、傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑的局限：陽離子脂質(zhì)體與PEI的毒性與強電荷困境

面對原代細胞轉(zhuǎn)染的挑戰(zhàn)，目前商業(yè)化的轉(zhuǎn)染試劑大多基于陽離子脂質(zhì)體（如Lipofectamine 2000、Lipofectamine3000等）或聚乙烯亞胺（PEI）等高分子聚合物。這些試劑雖在多種細胞系中表現(xiàn)出色，但其用于原代細胞時卻存在明顯缺陷。具體而言，陽離子脂質(zhì)體通過正電荷與核酸結(jié)合并吸附于帶負電的細胞膜，通過膜融合或內(nèi)吞作用進入細胞。然而，其強烈的正電荷特性易破壞細胞膜完整性，干擾膜電位，并可能引發(fā)顯著的細胞毒性，導(dǎo)致原代細胞存活率急劇下降。類似地，PEI雖能高效壓縮核酸形成復(fù)合物并通過“質(zhì)子海綿效應(yīng)”促進內(nèi)體逃逸，但其非降解性及高電荷密度會導(dǎo)致細胞內(nèi)代謝負擔(dān)加重、活性氧累積，并可能誘發(fā)炎癥反應(yīng)，對脆弱原代細胞的生理狀態(tài)造成不可逆損害。因此，盡管這些試劑在轉(zhuǎn)染機制上具有一定效力，但其固有的生物毒性嚴(yán)重限制了它們在原代細胞研究中的應(yīng)用，迫使研究者需在轉(zhuǎn)染效率與細胞活力之間做出艱難權(quán)衡。

其次，陽離子脂質(zhì)體或PEI這類成分在研發(fā)之初目的是轉(zhuǎn)染質(zhì)粒這種大分子，為了能夠與質(zhì)粒形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物就必須帶有很強的正電荷，然而這種強電荷對于siRNA轉(zhuǎn)染來說并不具備優(yōu)勢。siRNA通常僅有21bp左右，當(dāng)這種小分子遇到強電荷的載體時雖然會快速形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，但也由于電荷強度太大的原因而導(dǎo)致小分子核酸被吸附的很緊密，因此很難在胞漿內(nèi)得到充分釋放，這也是為什么很多研究者發(fā)現(xiàn)Lipofectamine 2000、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染siRNA時明明轉(zhuǎn)染陽性率很高、熒光很強（其實是熒光團聚），但基因沉默效率卻并不理想的原因。

綜合兩方面來看，傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑對于原代細胞的siRNA轉(zhuǎn)染還存在較大的局限性，并不是研究者進行原代細胞RNAi研究的最佳選擇。

三、新型轉(zhuǎn)染試劑的破局：可降解生物納米材料的創(chuàng)新優(yōu)勢

要想擺脫這樣的困境，研究者的目光就不能只盯著傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑，一些采用新型可降解生物納米材料作為遞送載體的siRNA轉(zhuǎn)染試劑比如RFectPMV2，已被多項研究證明可高效進行原代細胞（如單核細胞、心肌細胞、周細胞、小膠質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞等）的siRNA轉(zhuǎn)染。與傳統(tǒng)的陽離子脂質(zhì)體或PEI不同，RFectPM?V2的這種研發(fā)材料具備優(yōu)異的細胞膜親和特性和極低的細胞毒性：一方面，該材料經(jīng)過化學(xué)修飾，添加了親和原代細胞膜的基團，可顯著提高對原代細胞的siRNA轉(zhuǎn)染效率，并最大程度避免對細胞膜造成損傷，從而大幅減少了由轉(zhuǎn)染試劑本身引起的細胞應(yīng)激與毒性。另一方面，當(dāng)遞送載體將siRNA遞送入原代細胞胞漿后，載體自身就可迅速降解為無毒或低毒的小分子代謝產(chǎn)物，不僅避免了像傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑那樣由于不可降解而長期在胞內(nèi)積累帶來的副作用，還能在完成核酸遞送使命后及時清除，最大限度地維持了原代細胞的正常代謝與功能。

以下是我們實驗室使用RFectPMV2原代細胞siRNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染原代大鼠平滑肌細胞的熒光圖、明場圖以及基因沉默效率。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，RFectPMV2轉(zhuǎn)染FAM-NC到該細胞中轉(zhuǎn)染陽性率超90%；細胞死亡率僅5%左右，與正常培養(yǎng)的空白對照組細胞死亡率基本一致。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，相比于NC組，實驗組中轉(zhuǎn)染了對原代大鼠平滑肌細胞中單鏈DNA結(jié)合蛋白SSB基因的siRNA后，其相對mRNA表達水平可被敲降90%以上。