??Loss of function和gain of function是基因功能研究的最重要手段。傳統(tǒng)上，我們僅針對一個或者幾個基因進(jìn)行操作，以達(dá)到基因功能缺失或者獲得的目的。更大規(guī)模地批量進(jìn)行基因操作與功能分析是靶向篩選目標(biāo)基因的更有效手段。RNAi Screening就是一種專門用于基因功能缺失的大規(guī)模功能篩選策略；而隨著CRISPR/Cas9的發(fā)展，基于Cas9以及CRISPRi和CRISPRa的篩選策略也被開發(fā)出來，并廣泛用于耐藥基因篩選，功能基因研究等。以針對基因的敲除的CRISPR Screening為例，可以針對全基因組所有基因進(jìn)行sgRNA的設(shè)計，從而進(jìn)行基因敲除。理想情況下，每一個細(xì)胞中只有一種sgRNA整合進(jìn)基因組并發(fā)揮功能，如果有2萬個細(xì)胞，那么可以同時實現(xiàn)對2萬個基因的敲除，結(jié)合藥物篩選后者細(xì)胞表型選擇，可以獲得表型優(yōu)勢的細(xì)胞，然后將整合的sgRNA擴(kuò)增并進(jìn)行高通量測序，通過分析sgRNA序列即可判斷對應(yīng)的敲除基因；再結(jié)合表型優(yōu)勢細(xì)胞中sgRNA的富集程度，即可以篩選到促進(jìn)和抑制相應(yīng)表型的基因。換而言之，敲除后促進(jìn)表型的基因，其sgRNA在細(xì)胞中將得到富集；反之，敲除后抑制細(xì)胞表型的基因，其sgRNA在細(xì)胞中將被“丟失”。
??以上是常規(guī)CRISPR Screening的方法，而為了避免“搭車效應(yīng)”，即避免一個細(xì)胞中因同時出現(xiàn)多種基因敲除而互相干擾對其功能的現(xiàn)象，通常在進(jìn)行sgRNA慢病毒感染時，會使用低感染復(fù)數(shù)（MOI）的病毒進(jìn)行細(xì)胞感染，以保證每個細(xì)胞中最多進(jìn)入一個sgRNA慢病毒。但是這種策略同時也存在一定的問題：需要大量的細(xì)胞和多次生物學(xué)重復(fù)以獲得可靠的結(jié)果。這對于一些細(xì)胞來源受限的研究是一個比較大的障礙。今天分析的這項研究則可以使用高M(jìn)OI，少細(xì)胞，少生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行研究，其策略是針對相同的sgRNA引入不同的分子條碼（Internal Barcode，iBar）。例如，一條sgRNA，表示4種不同的iBar，那么一次實驗就相當(dāng)于進(jìn)行四次生物學(xué)重復(fù)實驗。
Reference
Zhu, S. et al. Guide RNAs with embedded barcodes boost CRISPR-pooled screens. Genome Biol 20, 20 (2019).
