1. 比對之前需要考慮哪些問題

1. 選什么作為參考序列

• 基因組序列
  既能做表達(dá)定量，還能發(fā)現(xiàn)新的基因和轉(zhuǎn)錄本
• 轉(zhuǎn)錄本序列（CDS / cDNA / 基因集）
  表達(dá)定量

2 gff/gtf的作用

• 在比對的過程中，提供基因組注釋文件可以指導(dǎo)spliced reads的定位
• 在統(tǒng)計(jì)reads數(shù)的時(shí)候，提供區(qū)間參考

3 選擇合適的比對工具

主要考慮是否需要spliced alignment
Bowtie、bwa

• 原核生物沒有內(nèi)含子，不存在可變剪接
• 小RNA的產(chǎn)生也沒有可變剪接過程
• 比對到轉(zhuǎn)錄本序列（因?yàn)橐呀?jīng)是接好的序列）

Tophat、STAR、hisat2

• 比對到基因組且基因有內(nèi)含子

2. Bowtie2比對

2.1 Bowtie與Bowtie2有什么區(qū)別

• Bowtie更適合短序列的比對，如小RNA測序reads; 另外它不允許gap
• Bowtie2更適合長序列（50堿基以上）的比對；允許gap

2.2 建索引

bowtie2-build -f Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa TAIR10.bybowtie

$ ls
TAIR10.bybowtie.1.bt2  TAIR10.bybowtie.3.bt2  TAIR10.bybowtie.rev.1.bt2
TAIR10.bybowtie.2.bt2  TAIR10.bybowtie.4.bt2  TAIR10.bybowtie.rev.2.bt2

2.3 比對

bowtie2 -q --phred33 -p 8 --no-unal -x TAIR10.bybowtie \
-1 SRR3286804_1.fastq.gz -2 SRR3286804_2.fastq.gz -S SRR3286804.sam

#參數(shù)說明
-q: 輸入文件為fastq
--phred33: 測序堿基的質(zhì)量體系，現(xiàn)在基本都是33
-p: 線程數(shù)
--no-unal：不保留未必對上的記錄
-x：索引前綴
-S：sam格式輸出