"牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）開發(fā)的第三代測序平臺是 目前唯一能夠直接對天然RNA鏈進(jìn)行測序的技術(shù)平臺。ONT - Direct RNA Sequecing (DRS，直接RNA測序）技術(shù)能夠?qū)μ烊蝗LRNA鏈進(jìn)行測序，同時(shí)能夠保留并檢測RNA堿基的修飾信息，并能夠相對準(zhǔn)確地估算 poly(A) 尾的長度，從而還原RNA的真實(shí)特征。"

圖1. Direct RNA Sequencing | Nature Method封面技術(shù) （2018年1月）

在過去的十年中，RNA測序（RNA-seq）逐漸成為了全轉(zhuǎn)錄組水平分析差異基因表達(dá)和研究mRNA差異剪接的不可或缺的工具。隨著第二代高通量測序技術(shù)（也稱Next-Generation Sequencing，NGS）的發(fā)展和成本的降低，RNA-seq的應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷擴(kuò)大。現(xiàn)在，RNA-seq已經(jīng)能夠應(yīng)用于很多RNA層面的研究，包括單細(xì)胞基因表達(dá)（single cell）、RNA翻譯組（translatome）和 RNA結(jié)構(gòu)組（structurome）等。近幾年興起的（令人激動的）新應(yīng)用也將RNA-seq帶入了三維空間，如空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（spatialomics）。
通過結(jié)合日益成熟的第三代長讀長測序（long-read）和 直接RNA測序（Direct RNA-seq）技術(shù)（圖1），以及更先進(jìn)的計(jì)算分析工具，RNA-seq將幫助科研人員對RNA生物學(xué)有更全面、更精細(xì)的理解: 從轉(zhuǎn)錄本在何時(shí)何地轉(zhuǎn)錄到RNA折疊以及分子互作發(fā)揮功能等^1,2。

近年來，隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）已經(jīng)成為研究基因表達(dá)調(diào)控的主要技術(shù)手段。很多物種的基因調(diào)控非常多樣和復(fù)雜，絕大多數(shù)真核生物基因不符合“一基因一轉(zhuǎn)錄本”的模式，這些基因往往存在多種剪切形式。通過二代測序，可以很準(zhǔn)確地進(jìn)行基因的表達(dá)及定量的研究，但是由于測序讀長的限制，不能精確的得到全長轉(zhuǎn)錄本的信息，以至于無法深入到轉(zhuǎn)錄本水平進(jìn)行研究（圖1）。因此，基于三代長讀長測序平臺的全長轉(zhuǎn)錄組成為新的研究熱潮。

全長轉(zhuǎn)錄組（Full-length transcriptome）是基于 PacBio（Pacific Biosciences） 或 ONT（Oxford Nanopore Technologies） 三代測序平臺，富集mRNA后無需打斷拼接，直接獲得包含5’UTR、3’UTR、polyA尾的mRNA全長序列及完整結(jié)構(gòu)信息，從而準(zhǔn)確分析有參考基因組物種可變剪接及融合基因等結(jié)構(gòu)信息，克服無參考基因組物種轉(zhuǎn)錄本拼接較短、信息不完整的難題（圖2）。

圖2. 短讀長、長讀長和直接RNA測序技術(shù)比較（RNA sequencing: the teenage years）

在全長轉(zhuǎn)錄組基礎(chǔ)之上，ONT-三代測序平臺的直接RNA測序（Direct RNA-seq），相對于傳統(tǒng)的 反轉(zhuǎn)錄cDNA - PCR擴(kuò)增（二代和三代RNA-seq測序都有相應(yīng)的建庫方案）流程，其能夠保留并檢測天然RNA堿基修飾信息，還原真實(shí)RNA特征，也省去了傳統(tǒng) RNA m6A甲基化修飾繁瑣的實(shí)驗(yàn)檢測步驟， 如 MeRIP-seq/m6A-seq和m6A-SEAL-seq等 。

一、RNA（mRNA）測序技術(shù)發(fā)展

超過95%的已發(fā)表的RNA-seq數(shù)據(jù)（Short Read Archive，SRA數(shù)據(jù)庫）都是由以Illumina平臺為代表的短讀長（short-read）第二代測序技術(shù)平臺生成的¹。由于短讀長cDNA測序方案的幾乎涵蓋了所有公開可用的mRNA-seq數(shù)據(jù)，這個(gè)技術(shù)作為RNA-seq的基準(zhǔn)，這一部分也主要圍繞mRNA的測序?yàn)橹饕獌?nèi)容。長讀長cDNA測序和最近的直接RNA測序方法將很快對二代測序平臺主導(dǎo)地位構(gòu)成挑戰(zhàn)，因?yàn)閷で竽軌蛱岣咿D(zhuǎn)錄本/異構(gòu)體水平上的分辨率和想要獲得RNA堿基修飾的需求在不斷涌現(xiàn)。

1. 短讀長（short-read）cDNA測序

短讀長（short-read）二代測序是轉(zhuǎn)錄組范圍基因檢測和表達(dá)定量最常見方式，其主要原因是它可以獲得全面的，高質(zhì)量的全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)?；贗llumina測序平臺的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)測序?qū)嶒?yàn)（RNA-seq）和分析包含以下核心步驟（以真核mRNA為例）：RNA的提取，mRNA的富集、cDNA的合成，接頭連接，PCR擴(kuò)增，上機(jī)測序和后期的數(shù)據(jù)分析（圖3）。

由于二代測序讀長限制，需要mRNA片段化和文庫純化時(shí)磁珠篩選300-500bp的片段，所以最后獲得的cDNA片段都在300-500bp左右（雙端150bp和雙端250bp建庫）。對于常規(guī)有參基因表達(dá)定量，每個(gè)樣本平均測到2000萬到3000萬條序列 （20-30 milion reads）就已經(jīng)足夠了，等同于雙端150bp （PE150）測序大約需要6G-9G （Gbase，Gb堿基數(shù)）的數(shù)據(jù)量；例如，150bp X 2端 X 20M reads = 6000 M = 6G，這里的6G數(shù)據(jù)量跟你看到的fastq.gz或者fastq文件大小（gigabyte，GB）還不是一回事，實(shí)際文件大小和壓縮比率還有關(guān)系；拿到原始序列的fastq.gz數(shù)據(jù)后，就可以對每個(gè)基因或轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行表達(dá)定量，最后再用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算統(tǒng)計(jì)組間差異表達(dá)的基因。

短讀長二代測序RNA-seq結(jié)果容錯(cuò)率相對較高（robust），對其多次測試比較發(fā)現(xiàn)，其平臺內(nèi)和平臺間的相關(guān)性都很好。然而在樣本準(zhǔn)備和計(jì)算分析階段的某些步驟中也會引入誤差和缺陷，這些局限性會影響特定生物問題的解釋，比如正確地識別和定量一個(gè)基因的多個(gè)轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體（isoform），尤其對于轉(zhuǎn)錄本較長或者多變的生物，如人的轉(zhuǎn)錄組中，50%的轉(zhuǎn)錄本長度大于2500 bp，轉(zhuǎn)錄本長度范圍在186 bp~109 kb之間。從根本上解決短讀長-cDNA測序固有局限性的最有效的方法還是通過長度長cDNA測序和直接RNA測序的方法。

圖3. Illumina平臺RNA-seq建庫和分析流程，圖片來自于Sudhagar, A.et.al

2. 長讀長（long-read）cDNA 測序

盡管以Illumina為代表的短讀長（short-read）二代測序是目前主流的RNA-seq平臺，但 PacBio 和 ONT 三代測序平臺能對反轉(zhuǎn)錄為cDNA后的全長mRNA進(jìn)行單分子實(shí)時(shí)測序。因?yàn)闆]有短序列的拼接組裝步驟，進(jìn)而克服了短讀長二代測序的一些問題 -- 例如序列比對的不確定性，無法直接還原較長的轉(zhuǎn)錄本的原貌 -- 有助于更好地捕捉轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體（isoform）的多樣性。

PacBio Iso-Seq， 基于PacBio三代測序平臺的mRNA Iso-Seq建庫測序流程能夠檢測長達(dá)15 kb的全長轉(zhuǎn)錄本序列，有助于發(fā)現(xiàn)大量先前未注釋到的轉(zhuǎn)錄本，并可通過全長序列確認(rèn)早期基于跨物種同源序列的基因預(yù)測結(jié)果。在標(biāo)準(zhǔn)的Iso-Seq實(shí)驗(yàn)中，模板置換（template-switching）逆轉(zhuǎn)錄酶可以將高質(zhì)量mRNA轉(zhuǎn)化為用來測序的全長cDNA，然后將得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并構(gòu)建PacBio SMRT（單分子實(shí)時(shí) single-molecule, real-time，SMRT）測序文庫。同時(shí)PacBio測序?qū)δ０辶啃枨蠛艽螅筮M(jìn)行大體積PCR，需要優(yōu)化反應(yīng)體系降低過度擴(kuò)增的影響。PCR末端修復(fù)和PacBio SMRT啞鈴狀測序接頭連接后，就可以上機(jī)測序了 （圖4）。一張SMRT cell 8M芯片能產(chǎn)生大約 4-5M 的序列（reads）。

圖4. PacBio Iso-Seq建庫和分析流程，圖片來源PacBio

ONT cDNA-PCR，基于ONT三代測序平臺的cDNA-PCR建庫測序流程也可以檢測全長轉(zhuǎn)錄本，而且適用于單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組測序。同樣使用模板置換反轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增來制備全長轉(zhuǎn)錄本文庫（圖5）。在加接頭制備測序文庫之前，可以自己決定是否進(jìn)行PCR擴(kuò)增，又可細(xì)分為PCR-cDNA和直接cDNA（雙鏈）測序。PCR擴(kuò)增的cDNA文庫的測序產(chǎn)出（測序獲得的reads數(shù)）更高，適用于樣本中RNA含量較少的情況。一般來說 6G（Gbase，Gb堿基數(shù)）數(shù)據(jù)量大約能獲得4-5百萬（million，M）條序列（reads）。

圖5. ONT-cDNA建庫流程，圖片來源Xiong, Q.et.al

3. 長讀長（long-read）直接RNA測序

2018年初，ONT-Direct RNA Sequencing技術(shù)登上了Nature Method的封面（圖1）。直到這兩年，此項(xiàng)技術(shù)整體趨向成熟，包括堿基準(zhǔn)確度的提升，價(jià)格的下降和修飾信號識別算法的提升。直接RNA測序建庫過程中沒有第二cDNA鏈的合成、PCR擴(kuò)增這些過程，不僅避免了這些操作帶來的偏好性和錯(cuò)誤， 并且保留了RNA上的表觀修飾信息。

首先，帶有oligo(dT)末端的引物與mRNA的PolyA尾巴退火連接；后續(xù)是一個(gè)可選的反轉(zhuǎn)錄操作，用于提高測序通量和RNA單鏈的穩(wěn)定性（一般推薦做）；最后添加連有分子馬達(dá)的測序接頭用于后續(xù)測序。文庫加載入MinION或PromethION芯片即可啟動3?poly(A)尾巴向5?cap端的mRNA直接測序。雖然直接RNA測序的價(jià)格相比于傳統(tǒng)RNA-seq高出不少且不支持混樣，但是其能直接檢測RNA堿基修飾的潛力有望在表觀轉(zhuǎn)錄組領(lǐng)域促進(jìn)更新的發(fā)現(xiàn)。

圖6. ONT RNA-cDNA建庫流程，圖片來源于Grünberger, F. et.al

二、需要反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增的RNAseq測序

對于二代測序平臺（Illumina & 華大DNBSEQ），傳統(tǒng)的RNA測序（如RNA-seq），無論是用 oligo（dT）引物 將 mRNA（真核生物）反轉(zhuǎn)錄 至 cDNA（complementary DNA，cDNA），再進(jìn)行 cDNA 的片段化 （圖7）；還是先將 mRNA 打斷，再結(jié)合六堿基隨機(jī)引物（Random Hexamers）反轉(zhuǎn)錄合成第一條 cDNA鏈隨后合成第二條cDNA鏈（圖7）， mRNA 都需要 反轉(zhuǎn)錄 成 cDNA，經(jīng)過PCR擴(kuò)增再進(jìn)行測序。

圖7.mRNA測序建庫流程

對于三代測序平臺（PacBio & ONT)，Iso-seq全長RNA測序試劑盒（Iso-Seq library preparation using SMRTbell prep kit 3.0，PacBio）和 cDNA-PCR測序試劑盒（cDNA-PCR Sequencing Kit V14，ONT）的原理基本類似，先用oligo（dT）引物反轉(zhuǎn)錄成全長mRNA-cDNA，再通過模板轉(zhuǎn)換引物（Template Switching Oligos ，TSO)，加入5'端PCR擴(kuò)增引物，最后通過PCR對全長轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增，然后建庫測序 (圖8，圖9）。

圖8. Iso-Seq library preparation using SMRTbell prep kit 3.0建庫流程

圖9. cDNA-PCR Sequencing Kit V14建庫流程

由于測序平臺原理的限制（Illumia的邊合成邊測序和PacBio依賴DNA聚合酶的單分子實(shí)時(shí)測序都需要DNA雙鏈），RNA測序都要通過RT-PCR構(gòu)建cDNA文庫，這個(gè)流程不僅過程繁瑣，還可能引入偏差和錯(cuò)誤（如PCR擴(kuò)增），從而影響最終結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，這些平臺技術(shù)都無法用于堿基修飾、mRNA的5'-甲基鳥苷帽以及3'-腺苷尾的研究。

三、ONT - 直接RNA測序（Direct RNA-seq，DRS）

正如上面展示的，經(jīng)典的RNA測序流程，通常需要將RNA先反轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后再進(jìn)行建庫測序。而直接RNA測序技術(shù)（Direct RNA Sequencing，簡稱DRS）只需將mRNA單鏈反轉(zhuǎn)錄為RNA - cDNA雙鏈后就能直接對其測序，整個(gè)過程無 RNA/cDNA 雙鏈轉(zhuǎn)DNA雙鏈和PCR擴(kuò)增過程，直接獲得mRNA的序列及其堿基修飾信息 （圖6）。

由于牛津納米孔科技（Oxford Nanopore Technologies，ONT）三代測序平臺的技術(shù)原理 ---- RNA/cDNA雙鏈能直接在馬達(dá)蛋白（Motor Protein）的牽引下與鑲嵌在合成聚合物膜上的納米孔蛋白（Nanopore Protein）結(jié)合并解螺旋；在膜兩側(cè)電壓差的作用下，RNA鏈以一定的速率通過納米孔通道蛋白。由于RNA鏈上不同堿基化學(xué)性質(zhì)存在差異，所以當(dāng)單個(gè)堿基通過納米孔通道時(shí)，會引起不同電學(xué)信號的變化。根據(jù)電流的大小及電流大小的變化情況，通過 “ 遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Recurrent Neural Network）”的復(fù)雜算法對堿基進(jìn)行判讀，即可計(jì)算獲得相應(yīng)堿基的類型，同時(shí)獲得堿基修飾信息（圖1，圖10） ---- 使得ONT三代測序平臺可以對全長mRNA序列進(jìn)行直接測序（Direct RNA sequencing）。

圖10. ONT測序平臺原理，圖來自 Wang, Y.et.al

1. ONT - 直接RNA測序的優(yōu)勢

• 直接RNA測序無需PCR，沒有測序GC偏好性

由于PCR過程具有GC偏好性（CG bias），對GC含量過高或過低的序列不容易擴(kuò)增，所以短讀長測序在建庫和測序過程中都會引入GC偏好，降低了定量分析的準(zhǔn)確性。使用ONT測序技術(shù)（直接 cDNA & 直接 RNA），無需PCR擴(kuò)增，可以提供無偏倚(bias)、全長、鏈特異性的RNA序列。

• 準(zhǔn)確檢測轉(zhuǎn)錄本 poly(A) 尾長度

轉(zhuǎn)錄本 poly(A) 尾被認(rèn)為在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起到重要作用，包括mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。poly(A) 尾長度可達(dá)數(shù)百個(gè)核苷酸，使用短讀長測序的數(shù)據(jù)很難進(jìn)行測量。ONT-直接RNA測序獲得的全長轉(zhuǎn)錄本包含 poly(A) 尾信息，利用算法工具計(jì)算出 poly(A) 尾的長度，估算每個(gè)讀長序列的 poly(A) 尾長，甚至能夠發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體 (isoform) 間 poly(A) 尾的區(qū)別。

• 直接RNA測序鑒定 RNA 堿基修飾信息

反轉(zhuǎn)錄cDNA - PCR擴(kuò)增的建庫方式需要 PCR擴(kuò)增，從而丟失了 RNA 分子中的堿基修飾信息。直接RNA測序不需要擴(kuò)增或鏈合成，這意味著在測序過程中，修飾堿基直接穿過納米孔，在原始信號中產(chǎn)生與未發(fā)生修飾的堿基不同的電流特征。通過特定的軟件算法對電流特征進(jìn)行識別，即可鑒定堿基修飾信息。

2. ONT - 直接RNA測序推薦用戶

• 對天然RNA特征感興趣，想探索RNA堿基修飾信息。

• 想要去除反轉(zhuǎn)錄或PCR的偏倚，即偏好性和錯(cuò)配率。

• 對mRNA兩端非編碼調(diào)控區(qū)域感興趣，如5',3' UTR 和 poly(A)尾。

• 樣本中存在比較難反轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄本。

3. ONT - 直接RNA測序建庫流程

所用的試劑盒為Direct RNA Sequencing Kit (SQK-RNA004)，首先準(zhǔn)備 poly(A) 富集的mRNA (300ng/8ul) 或者總RNA(1ug/8ul) ，通過 poly(T) 引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈（穩(wěn)定mRNA），為RNA-cDNA加上測序接頭，最后在MinION或PromethION芯片上進(jìn)行測序（圖11），建庫總用時(shí)大約為2小時(shí)15分鐘?；パa(bǔ)cDNA鏈不會被測序，只是為了提升RNA的穩(wěn)定性和測序質(zhì)量。

圖11. ONT - 直接RNA測序建庫流程

四、ONT - 直接RNA測序 數(shù)據(jù)分析

ONT Direct RNA測序的常規(guī)分析流程（人和mRNA為例）包括：
（1）原始數(shù)據(jù)的質(zhì)控
（2）參考轉(zhuǎn)錄組比對（將聚類得到全長轉(zhuǎn)錄本和參考注釋進(jìn)行比對并分類）
（3）基因功能及轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)注釋
（4）差異基因/轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體（isoform）定量&差異表達(dá)分析
（5）差異可變剪切（Alternative Splice）分析
（6）KEGG信號通路富集、蛋白互作分析
（7）RNA堿基修飾檢測
（8）Poly(A) 尾長度估算/可變多聚腺苷化（APA）分析

前六個(gè)分析和全長轉(zhuǎn)錄組（cDNA/PCR建庫）分析流程一致，具體流程和軟件使用可以參考 Wang, Yunhao, et al. "Nanopore sequencing technology, bioinformatics and applications." Nature Biotechnology. (2021)。這里重點(diǎn)總結(jié)一下 直接RNA測序所特有的 堿基修飾（6mA) 和 可變多聚腺苷化（APA） 分析。

1. ONT - 直接RNA測序（Direct RNA Sequencing，DRS）m6A的數(shù)據(jù)分析工具

對于快速了解現(xiàn)有的基于ONT DRS平臺實(shí)現(xiàn)m6A檢測的算法工具和流程，一篇深入的評估測評文章無疑是最佳起點(diǎn)。這里推薦由 駱觀正 和 張璋 教授合著的論文，該論文于2023年4月5日發(fā)表在《自然通訊》（Nature Communications）上，題為"Systematic comparison of tools used for m6A mapping from nanopore direct RNA sequencing"。這篇文章對現(xiàn)有常用的檢測和量化RNA m6A修飾的算法工具進(jìn)行了全面的測評和比較研究（圖12）。通過此文章，我們可以了解主流的分析軟件和流程都有哪些，這里暫不對這些軟件的使用方法做詳細(xì)的描述，給自己挖個(gè)坑，后面對于每個(gè)常用軟件出一期使用教程。

圖12. 利用ONT DRS平臺實(shí)現(xiàn)m6A檢測的工具、流程以及原理分類。Zhong, Z.D et.al

基于鑒定修飾核苷酸所使用的策略不同，現(xiàn)有的工具大致可分為兩大類（圖12）。第一類，依賴于 檢測識別 核苷酸通過納米孔時(shí)產(chǎn)生的不同電流擾動信號，將連續(xù)的電流信號切分成小的 "events"，進(jìn)行堿基的識別；利用兩個(gè)比較流行的算法之一，Nanopolish-eventalign 或 Tombo-resquiggle，將每一個(gè)核苷酸和參考序列進(jìn)行比對；對于每一個(gè)核苷酸，電流信號，例如中位數(shù)，平均值，方差和滯留時(shí)間等被提取出來，作為以三個(gè)不同分類方法為基礎(chǔ)軟件的輸入文件：統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（如 Tombo），機(jī)器學(xué)習(xí)（如 MINES， Nanom6A和m6Anet）和聚類（如Nanocompore，xPore）。第二類，利用由于修飾存在而產(chǎn)生的堿基識別擾動（"errors"），這些堿基識別時(shí)的 "errors"可能代表錯(cuò)配，插入，缺失或不同的堿基質(zhì)量，結(jié)合比對結(jié)果，這些信息被搜集和分類。在這些擾動中識別修飾堿基，Epinano軟件使用預(yù)先訓(xùn)練的機(jī)器學(xué)習(xí)模型，其它的軟件通過利用內(nèi)部模型或?qū)φ諛颖具M(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)來識別修飾堿基，如DiffErr，DRUMMER和ELIGOS。

- Dorado (ONT官方）

Dorado是一款高性能、易于使用、開源的牛津納米孔測序數(shù)據(jù)堿基識別（basecaller）的軟件，也是ONT官方是最新推薦使用的堿基識別軟件。其利用官方開發(fā)的Remora訓(xùn)練的核苷酸修飾模型進(jìn)行RNA修飾堿基的識別。對于修飾堿基后續(xù)處理分析可使用官方推薦的modkit。

- Tombo

Tombo是一套工具，主要用于從納米孔測序數(shù)據(jù)中鑒定修飾的核苷酸，可用于RNA修飾堿基的識別和可視化。Tombo 還提供了用于分析和可視化原始納米孔信號的工具。此為早期ONT官方推薦的軟件，最后一個(gè)版本停留在2020年2月20日，現(xiàn)在已經(jīng)停止更新維護(hù)，被官方新開發(fā)的Remora所替代。Stoiber, M.H. et al. De novo Identification of DNA Modifications Enabled by Genome-Guided Nanopore Signal Processing. bioRxiv (2016).

- MINES

MINES - (m)6A (I)dentification Using (N)anopor(E) (S)equencing- 文章由來自UC San Diego的 Gene Yao 教授團(tuán)隊(duì)（圖13）于2020年1月發(fā)表在RNA雜志上，題目為Direct RNA sequencing enables m6A detection in endogenous transcript isoforms at base-specific resolution。從github上的日志來看，已經(jīng)有4-5年沒有更新了，而且運(yùn)行MINES之前需要運(yùn)行Tombo(v1.4)。

圖13 . Yao Lab團(tuán)隊(duì)

- Nanom6A

Nanom6A，是一款基于XGBoost（Extreme Gradient Boosting）模型，直接利用m6A周圍的原始信號，在單核苷酸水平上對每一個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行m6A位點(diǎn)的鑒別。此流程由福建農(nóng)林大學(xué)海峽聯(lián)合研究院林學(xué)中心的 顧連峰 教授課題組于2021年1月7日，在Genome Biology上發(fā)表： Quantitative profiling of N6-methyladenosine at single-base resolution in stem-differentiating xylem of Populus trichocarpa using Nanopore direct RNA sequencing。該研究提供了一種可在單轉(zhuǎn)錄本單堿基水平的分辨率定量m6A修飾的方法，為在動植物中的m6A修飾研究提供了一種極為有效的檢測手段。默認(rèn)模型只適用于 MinION 或 GridION機(jī)型的 R9.4.1 芯片。

- m6Anet

m6anet ，利用多實(shí)例學(xué)習(xí)（Multiple Instance Learning）框架來從納米孔直接RNA測序數(shù)據(jù)中檢測 m6A 修飾。新加坡 A-STAR 基因組研究所 (GIS) / 新加坡國立大學(xué) Jonathan Goke （圖14）與 Alexandre Thiery 研究組合作于2022年11月10日，在Nature Methods上發(fā)表了題目為Detection of m6A from direct RNA sequencing using a multiple instance learning framework的研究論文。該研究提出了一種基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)檢測 RNA 修飾的新方法，m6Anet 。m6Anet 可以從單次直接 RNA 測序數(shù)據(jù)中獲得轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的 m6A 識別和量化信息。最新的版本為v.2.1.0，最近更新于2023年07月23號。

圖14. Jonathan Goke團(tuán)隊(duì)

- Nanocompore

Nanocompore用于比較來自兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)組的ONT-直接RNA測序數(shù)據(jù)集，來檢測差異的RNA修飾，建議每組有兩個(gè)重復(fù)樣本。英國劍橋大學(xué) Tony Kouzarides 教授團(tuán)隊(duì)于2021年12月10日，在Nature Communications上發(fā)表了RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing的研究。團(tuán)隊(duì)開發(fā)并驗(yàn)證了Nanocompore軟件，一個(gè)可以從Nanopore direct RNA-seq測序數(shù)據(jù)中識別堿基修飾的分析框架（圖15）。將感興趣的RNA和未做處理的對照樣本進(jìn)行比較，不需要訓(xùn)練集，并且允許重復(fù)樣本數(shù)據(jù)。Nanocompore**在體外可以準(zhǔn)確地檢測到不同的RNA修飾，也可以用于酵母和人類RNA中m6A修飾圖譜，以及靶向非編碼RNA的鑒別。

圖15. Nanocompore分析流程

- xPore

xPore是一款基于Python語言利用ONT-直接RNA測序數(shù)據(jù)對RNA修飾進(jìn)行鑒定和定量。新加坡 A-STAR 基因組研究所（GIS）/ 新加坡國立大學(xué) Jonathan Goke 研究組和深圳灣實(shí)驗(yàn)室分子生理學(xué)研究所 吳煒祥（W.S. Sho Goh） 課題組于2021年7月19日，在Nature Biotechnology雜志上發(fā)表了題為Identification of differential RNA modifications from nanopore direct RNA sequencing with xPore的研究，開發(fā)了基于Nanopore direct RNA-seq的RNA修飾差異化分析計(jì)算方法xPore。xPore可以實(shí)現(xiàn)單堿基水平（single-base resolution ）的甲基化位點(diǎn)鑒定、甲基化水平計(jì)算，在沒有配對未修飾樣品對照組的情況下進(jìn)行樣品間的甲基化差異分析，xPore為臨床樣本、原代培養(yǎng)組織等缺乏相應(yīng)對照組的甲基化差異分析提供了技術(shù)支持。最新的版本為v.2.1，更新于2021年10月09號。

- Epinano

Epinano是一款利用ONT-直接RNA測序數(shù)據(jù)檢測RNA修飾的軟件。西班牙巴塞羅那科學(xué)研究院（Barcelona Institute of Science and Technology）的 Eva Maria Novoa 團(tuán)隊(duì)（圖15）于2019年9月9號，在Nature Communications上發(fā)表了題目為Accurate detection of m6A RNA modifications in native RNA sequences的研究, 開發(fā)了利用Nanopore direct RNA-seq數(shù)據(jù)預(yù)測RNA中m6A修飾的算法，名為EpiNano，此算法基于系統(tǒng)誤差和堿基質(zhì)量下降等信息檢測m6A修飾。最新的版本為v.1.2.4，更新于2024年4月27號。

圖15：Eva Maria Novoa團(tuán)隊(duì)

- DiffErr

DiffErr是由英國鄧迪大學(xué)（University of Dundee）Geoff Barton 團(tuán)隊(duì)開發(fā)的算法。算法基于Nanopore DRS測序的錯(cuò)誤，需要低堿基修飾的對照。輸入數(shù)據(jù)需要測序樣本使用同一芯片，同一建庫試劑盒，同一時(shí)間完成測序，并且使用相同軟件算法來call堿基，否則就會有大量假陽性。軟件最后一次更新停留在2020年11月27號，對于不同批次的數(shù)據(jù)非常不友好。

- DRUMMER

DRUMMER旨在通過比較ONT-直接RNA測序數(shù)據(jù)集中的堿基鑒別錯(cuò)誤（basecall errors），識別不同轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體上的RNA修飾，達(dá)到核苷酸級別的分辨率。美國紐約大學(xué) Daniel P Depledge 團(tuán)隊(duì)于2022年4月15號，在Bioinformatics上發(fā)表了題目為DRUMMER—rapid detection of RNA modifications through comparative nanopore sequencing的研究，開發(fā)了DRUMMER (Detection of Ribonucleic acid Modifications Manifested in Error Rates) 算法軟件。算法基于一系列統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)和信號背景噪音校正來鑒定修飾的核酸堿基。軟件自發(fā)表以來沒有進(jìn)行更新。

- ELIGOS

ELIGOS 是一款利用天然RNA和參考序列之間特定堿基上的錯(cuò)誤（error at specific base，ESB）差異，來識別RNA序列上修飾位點(diǎn)而開發(fā)的軟件。美國阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院（University of Arkansas for Medical Sciences） 的 Intawat Nookaew 教授團(tuán)隊(duì)和芝加哥大學(xué)的 何川 教授團(tuán)隊(duì)于2021年1月25號，在Necleic Acids Research上發(fā)表了題目為Decoding the epitranscriptional landscape from native RNA sequences的研究，開發(fā)了ELIGOS（Epitranscriptional/(Epigenomical) Landscape Inferring from Glitches of ONT Signals）。ELIGOS能夠在大腸桿菌、酵母和人類細(xì)胞中準(zhǔn)確預(yù)測已知類別的RNA甲基化位點(diǎn)。

- 其它分析軟件

在 Jonathan Goke 實(shí)驗(yàn)室github主頁的 awesome-nanopore 里有一個(gè)關(guān)于ONT數(shù)據(jù)分析軟件的列表，里面總結(jié)了相應(yīng)方向數(shù)據(jù)分析推薦的軟件。其中也推薦了RNA修飾方向的一系列相關(guān)軟件（圖16）。大家也可以自行查看參考綜述里沒提及的分析軟件，例如nanoDoc2。

圖16. RNA修飾方向分析軟件推薦

2、RNA可變多聚腺苷酸化（alternative polyadenylation, APA）原理及分析工具

mRNA在加工過程中的精細(xì)調(diào)控對基因的表達(dá)具有重要影響，也是產(chǎn)生基因功能多樣性的重要機(jī)制。真核生物mRNA3' 端都由一個(gè)約200個(gè)腺苷的 ploy(A) 尾組成。前體mRNA（pre-mRNA）在成熟過程中，環(huán)境或生理的細(xì)微變化能夠?qū)е略?strong>mRNA的不同剪切位點(diǎn)上進(jìn)行選擇性的剪切和多聚腺苷酸化（cleavage and polyadenylation, C/P），可變剪切和多聚腺苷酸化的發(fā)生需要多聚腺苷酸化信號（polyadenylation signal，PAS，典型序列AAUAAA）的存在。可變多聚腺苷化（Alternative polyadenylation， APA）則是指具有多個(gè) PAS 的序列，在其mRNA的3' 端成熟過程中，由于選擇不同的PAS，導(dǎo)致產(chǎn)生出多個(gè)3' UTR長度和序列組成不同的轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體 （圖17）。

一般可變多聚腺苷化（APA），可以分為四種類型：

1. 3' UTR APA：3' UTR區(qū)內(nèi)有兩個(gè)或者兩個(gè)以上的PAS，如 Proximal PAS（近端）和 Distal PAS（遠(yuǎn)端），產(chǎn)生具有不同長度的3' UTR的異構(gòu)體（isoform），并不影響蛋白編碼功能，是最常見的APA形式 （圖17 A）。

2. 可變末端外顯子APA 或稱 剪切APA：產(chǎn)生末端外顯子和3'UTR不同的異構(gòu)體（isoform），影響編碼蛋白C端氨基酸的序列（圖17 B）。

3. 內(nèi)含子APA：內(nèi)含子區(qū)域存在PAS，延長了某個(gè)內(nèi)部外顯子并使之成為末端外顯子（圖17 C）。

4. 內(nèi)部外顯子APA：在編碼區(qū)域內(nèi)部發(fā)生剪切和多聚腺苷酸化（圖17 D）。

圖17. 可變多聚腺苷酸化，Zhang, Y er.al.

通過在RNA 3' UTR區(qū)不同位置上添加polyA尾巴，可以選擇性的調(diào)節(jié)3' UTR的長短。由于3' UTR區(qū)含有多種順式調(diào)控元件，例如：miRNA或RNA結(jié)合蛋白（RBP）結(jié)合位點(diǎn)，因此，APA可以通過調(diào)節(jié)3' UTR區(qū)的長度，影響目標(biāo)mRNA的穩(wěn)定性，定位和翻譯效率，最終導(dǎo)致它們具有不同的生物學(xué)功能； 發(fā)生在編碼區(qū)內(nèi)部的APA可以影響蛋白質(zhì)翻譯序列，進(jìn)而影響其生物學(xué)功能。

對于三代測序數(shù)據(jù)RNA可變多聚腺苷酸化分析工具，大家可以自行探索以下軟件，如TAPAS，DaPars，NanoPrapi，LAPA，DeeReCT-APA，DeepPASTA等。因?yàn)楸救瞬皇亲鲞@個(gè)方向，如有不全或錯(cuò)誤之處還請大家?guī)兔ρa(bǔ)充和更正。

對于估計(jì)polyA長度的軟件：

- Dorado (ONT官方）

Dorado是一款高性能、易于使用、開源的牛津納米孔測序數(shù)據(jù)堿基識別（basecaller）的軟件，也是ONT官方是最新推薦使用的堿基識別軟件。使用 --estimate-poly-a 命令選項(xiàng)即可開啟預(yù)估poly(A)長度選項(xiàng)。

- tailfindr

tailfindr 是一款利用ONT reads來估算polyA尾長度的R包。

挪威卑爾根大學(xué)（University of Bergen）Eivind Valen 教授團(tuán)隊(duì)于2019年10月25號，在RNA上發(fā)表了題目為tailfindr: alignment-free poly(A) length measurement for Oxford Nanopore RNA and DNA sequencing的研究，開發(fā)了名為tailfindr的R包。 tailfindr可以直接從ONT原始的FAST5格式數(shù)據(jù)直接估計(jì)每條序列的 poly(A) 長度。

五、RNA表觀遺傳修飾類型以及功能

ONT - Direct RNA Sequecing (DRS，直接RNA測序）技術(shù)主要優(yōu)勢之一還是在于其能直接檢測RNA上的表觀遺傳修飾。

之前大家圍繞染色質(zhì)上的 DNA 和 Protein 開始表觀遺傳學(xué)的研究，包括DNA 甲基化，染色質(zhì)可及性，組蛋白修飾，3D 基因組等等 (圖18)。傳統(tǒng)經(jīng)典的遺傳學(xué)基本法則（Central dogma, 中心法則）中的RNA確"被大家忽略了"。這種尷尬的局面，在2011 年10月16號，由芝加哥大學(xué)何川教授團(tuán)隊(duì)率先打破。他們的研究 "N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO" 發(fā)表在 Nature Chemical Biology上，首次證明 FTO（fat mass and obesity-associated protein）是RNA上m6A（N6-methyladenosine）修飾的去甲基化酶，揭示m6A的可逆化修飾，且說明了RNA 層面的修飾也參與了基因表達(dá)調(diào)控。m6A作為mRNA上最豐富的可逆修飾受到了極大地關(guān)注，并從此開啟了RNA表觀遺傳學(xué)的浪潮，使 m6A 的研究重新熱門起來。

“隨著ONT direct RNA技術(shù)的發(fā)展與普及，將會極大推動RNA表觀遺傳學(xué)的研究”。

圖18. DNA和Protein的表觀遺傳修飾， Laura Bonetta，Epigenomics: The new tool in studying complex diseases.

RNA表觀遺傳修飾是指發(fā)生在RNA堿基上的各種化學(xué)修飾，這些修飾通常不會改變基因的序列，但會影響其在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)、功能、剪接加工、轉(zhuǎn)運(yùn)定位、聚腺苷酸化（polyadenylation）、翻譯等從而調(diào)控多種生物過程。在生物體內(nèi)，RNA修飾是通過多種酶在轉(zhuǎn)錄后或共轉(zhuǎn)錄時(shí)引入的，RNA分子也可以從外部來源獲得修飾，如環(huán)境或其它生物體。迄今為止，根據(jù)波蘭華沙國際分子與細(xì)胞生物學(xué)研究所 (IIMCB) ，Janusz M. Bujnicki 教授團(tuán)隊(duì)（圖19，圖20）開發(fā)的RNA修飾數(shù)據(jù)庫MODOMICS顯示，在所有類型的RNA分子中已經(jīng)確定了超過170種RNA修飾（從2006年更新至2023年）（Cappannini, A; Bujnicki, J. M.et.al)，編碼RNA （mRNA）和非編碼RNA（tRNA, rRNA, miRNA, lncRNA, circRNA, etc.）都可以被修飾（圖21）?，F(xiàn)在認(rèn)為表觀遺傳修飾和遺傳物質(zhì) DNA 一樣，都是決定基因表達(dá)和個(gè)體表型的重要因素，與生物發(fā)育和疾病發(fā)生息息相關(guān)。

圖19. Janusz M. Bujnicki教授

圖20. Janusz M. Bujnicki教授團(tuán)隊(duì)

當(dāng)前已知的RNA修飾之中，研究較多的RNA修飾如下（圖21）：
① N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine, m6A)
② 5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, m5C)
③ N1-甲基腺苷(N1-methyladenosine, m1A)
④ N7-甲基鳥苷(N7-methylguanosine, m7G)
⑤ N4- 乙酰胞嘧啶 (N4-acetylcytosine, ac4C)
⑥ 假尿苷 (pseudouridine, Ψ)
⑦ 尿苷化(uridylation)
⑧ 腺苷到肌苷的RNA 編輯(adenosine-to-inosine (A-to-I) RNA editing)

圖21. RNA修飾及類型分布，Cui, L et.al

N6-甲基腺嘌呤(m6A)，即腺苷酸氮堿基 的6號位 N 發(fā)生甲基化， 是mRNA中豐度最高的甲基化修飾形式，也是目前研究最為透徹的一種RNA修飾類型。其可以被甲基轉(zhuǎn)移酶“寫”、去甲基酶“擦除”及結(jié)合蛋白“讀”。在第一個(gè)去甲基化酶 FTO 被發(fā)現(xiàn)后，在眾多科學(xué)家的共同努力下，逐漸構(gòu)建起了較為清晰的 m6A 修飾通路。這里包含三種核心調(diào)控因子：Writer（寫），Eraser（擦除），Reader（讀?。?，它們分別執(zhí)行針對 m6A 的三種任務(wù)：加入修飾，擦除修飾，讀取修飾 （圖22，參考知乎-白墨）。

1. 加入修飾（Writer），主要由甲基化轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成的復(fù)合物（Methyltransferase complex，MTC）介導(dǎo)產(chǎn)生，包括 METTL3、METTL14和 WTAP和 KIAA1429。

2. 擦除修飾（Eraser），F(xiàn)TO 和 ALKHB5 等去甲基化酶構(gòu)成，用于擦除甲基化基團(tuán)。FTO蛋白全稱Fat mass and obesity-associated protein，屬于Alkb蛋白家族中的一員并且與肥胖相關(guān)，敲除后，m6A修飾水平顯著上升。LKBH5是另一種重要的去甲基化酶，對細(xì)胞核中的mRNA進(jìn)行去甲基化修飾。在細(xì)胞系中敲低ALKBH5后，mRNA上m6A修飾水平顯著上升。

3. 讀取修飾（Reader），多種 Reader 蛋白會執(zhí)行不同的生物學(xué)功能，常見的有：

• YTHDF1 和 YTHDF3 通過與起始因子及核糖體互相作用促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯
• YTHDF2 導(dǎo)致 mRNA 的降解，而 YTHDF3 與 YTHDC2 有類似的功能
• IGF2BP1/2/3 則對翻譯的穩(wěn)定性有促進(jìn)作用
• YTHDC1 與 mRNA 剪切及出核有關(guān)
• eIF3 識別蛋白也會直接綁定到 mRNA 5'UTR 端的 m6A 位點(diǎn)參與翻譯起始
• HNRNPC 介導(dǎo) mRNA 前體的選擇性剪接
• HNRNPA2B1 促進(jìn) pri-miRNA 加工為 pre-miRNA

圖22. RNA m6A修飾調(diào)控

六、ONT - 直接RNA測序 應(yīng)用場景

Oxford Nanopore Technologies (ONT) 測序平臺的直接RNA測序技術(shù)是一種能夠直接測定RNA分子序列以及其表觀遺傳修飾的方法，不需要將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

這種技術(shù)除了常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組分析應(yīng)用，如：

1. 全長轉(zhuǎn)錄本鑒定：

   • 直接RNA測序能夠測定完整的RNA分子，避免了傳統(tǒng)測序方法中由于逆轉(zhuǎn)錄和片段化引入的偏差。這對于研究全長轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)、剪接變體和基因融合事件非常重要。

2. 轉(zhuǎn)錄組分析：

   • 可以用于生物樣本的轉(zhuǎn)錄組分析，幫助識別和定量表達(dá)基因和轉(zhuǎn)錄本。這對于揭示差異表達(dá)基因（或轉(zhuǎn)錄本）和功能具有重要意義。

3. 癌癥研究：

   • 能夠識別癌癥細(xì)胞中的異常轉(zhuǎn)錄事件和基因融合，對于理解癌癥的分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和開發(fā)新的治療策略具有重要應(yīng)用。

其還有許多獨(dú)特的應(yīng)用場景和優(yōu)勢，包括以下幾個(gè)方面：

1. 病毒和病原體檢測：
   • 在病毒學(xué)研究中，直接RNA測序可以快速、準(zhǔn)確地測定病毒RNA序列，有助于病毒株的鑒定、突變檢測和流行病學(xué)研究。尤其適用于RNA病毒，如冠狀病毒、流感病毒等。

• 探索病毒生命周期、變異監(jiān)控、宿主-病毒互作以及病毒基因表達(dá)的復(fù)雜性方面。

2. 合成生物學(xué)：

   • 在合成生物學(xué)研究中，可以用于測定和驗(yàn)證人工合成的RNA分子，確保其序列和結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。

3. 藥物研發(fā)：

   • 在藥物研發(fā)過程中，直接RNA測序可以用于評估藥物對基因表達(dá)和RNA修飾的影響，從而加速藥物篩選和優(yōu)化。

直接RNA測序技術(shù)的這些應(yīng)用場景表明，它不僅在基礎(chǔ)研究中具有重要價(jià)值，而且在臨床診斷、公共衛(wèi)生和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中也具有廣泛的應(yīng)用前景。

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