題目：Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis
期刊：Molecular Cell
影響因子：14.248
主要技術(shù)：RNA-Seq、CRISPR/Cas9、circRNA FISH
研究背景
環(huán)狀RNAs（circRNAs）是一個(gè)具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄子家族，其大部分功能仍然是未知的。近幾年在探究circRNA的成環(huán)機(jī)制和調(diào)控機(jī)制中，越來越多的證據(jù)證明其在人類疾病中的潛在作用，且很大程度上與生物進(jìn)程相關(guān)。
在本項(xiàng)研究中，作者發(fā)現(xiàn)circRNAs調(diào)控了小鼠和人類肌肉分化過程，且其表達(dá)量在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良（DMD）成肌細(xì)胞中發(fā)生改變。通過特定的基因敲除策略和高含量的表型篩選，初步確定circ-ZNF609參與控制肌生成的過程，并根據(jù)肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)能力，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與circRNA翻譯過程相關(guān)。
研究?jī)?nèi)容及結(jié)果
[if !supportLists]1.?[endif]circRNAs在分化的哺乳動(dòng)物成肌細(xì)胞中含量豐富、相對(duì)保守和高表達(dá)
本文采用在生長(zhǎng)培養(yǎng)基（GM）中培養(yǎng)或誘導(dǎo)分化為肌管的人類和小鼠成肌細(xì)胞，提取總RNA后進(jìn)行末端核糖核酸酶RNA序列分析（RNA-Seq），并通過FindCirc軟件檢測(cè)出circRNAs，結(jié)合qRT-PCR驗(yàn)證RNA序列數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示，在人類和小鼠樣本中均發(fā)現(xiàn)數(shù)千個(gè)環(huán)狀剪接事件，通過基因組的注釋和編碼區(qū)域的結(jié)構(gòu)注釋發(fā)現(xiàn)，幾乎有90%來自于編碼蛋白質(zhì)的基因內(nèi)外顯子（圖1B），近10% circRNAs相對(duì)于線性RNA呈現(xiàn)出高度表達(dá)狀態(tài)。韋恩圖顯示出在人類和小鼠中分別鑒定的2100和1600種環(huán)狀RNA，且其中均有近600種是保守的（圖1C）；。在樣本信息中篩選高水平表達(dá)的人類環(huán)狀物時(shí)（超過5次讀取），與小鼠環(huán)狀物的重疊性從25%增加到40%，可以讀出人類的基因組與小鼠存在同生性的區(qū)域重疊（圖1D）。
圖1在分化的哺乳動(dòng)物成肌細(xì)胞中鑒定circRNAs
[if !supportLists]2.?[endif]肌肉分化及疾病樣本中circRNA的表達(dá)差異
通過選擇肌肉分化和肌肉疾病的樣本，來定量分析circRNA的表達(dá)情況和調(diào)節(jié)機(jī)制。如圖2A-2B所示，散點(diǎn)圖顯示了肌母細(xì)胞（GM）和肌管（DM）在高表達(dá)circRNA中的讀取映射，結(jié)合熱圖中正常樣本（WT）和杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良疾病樣本(DMD)的circRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)了在不同細(xì)胞中circRNA表達(dá)水平不一。同樣，在相同基因組坐標(biāo)下線性和環(huán)性讀取比率也遵循類似趨勢(shì)（圖2C-2D），可能與RNA分子穩(wěn)定性有關(guān)。根據(jù)Cuffdiff計(jì)算FPKMs后的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)條形圖得知，相對(duì)于下調(diào)和非差異基因，上調(diào)基因明顯地誘導(dǎo)circRNA表達(dá)（圖2E-2F）。從circ-BNC2和circ-CDYL基因座的覆蓋圖來看，circ-CDYL可能是由于基因座的轉(zhuǎn)錄而被激活，且在肌細(xì)胞生成過程中環(huán)狀和線性的讀取同時(shí)增加。
圖2在人類成肌細(xì)胞分化與疾病中circRNA差異性表達(dá)
[if !supportLists]3.?[endif]人類肌細(xì)胞的circRNA的基因敲除和表型篩選
首先基于RNAi進(jìn)行circRNA功能篩選，針對(duì)29個(gè)circRNA來設(shè)計(jì)兩個(gè)小干擾RNA（siRNAs）。圖3A中的示意圖顯示表型篩選策略的實(shí)驗(yàn)工作流程；圖3B中熱圖顯示兩個(gè)siRNAs 都抑制成肌細(xì)胞分化（每列表示一個(gè)表型，每行表示一個(gè)樣本）。對(duì)兩種常見的肌生成標(biāo)記物（肌生成素、肌球蛋白重鏈）進(jìn)行免疫熒光分析及DAPI染色，采用對(duì)照干擾siRNAs（si-SCR）、對(duì)抗circ-QKI的siRNAs (si-QKI #1) 和circ-BNC2 (si-BNC2 #1)分別誘導(dǎo)分化48h和96h，可觀察到表型變化與BNC2基因敲除相關(guān)。與此同時(shí)，結(jié)合qRT-PCR驗(yàn)證，可推測(cè)在肌細(xì)胞分化開始時(shí)circ-BNC2可能與抗肌源性BNC2-mRNA產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制（圖3C-3D）。
圖3人類肌細(xì)胞的circRNA的基因敲除和表型篩選
[if !supportLists]4.?[endif]?circ-ZNF609調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖
在補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中，通過溴脫氧尿苷標(biāo)記分析成肌細(xì)胞中一組高表達(dá)circRNA與細(xì)胞增殖能力之間的關(guān)系。分別采用對(duì)照干擾siRNAs（si-SCR）和一系列對(duì)抗的siRNAs 治療人類成肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)circ-ZNF609（siRNA #1）敲除組的BrdU熒光值顯著地下降了80%（圖4A）。圖4B顯示circ-ZNF609表型驗(yàn)證的siRNAs技術(shù)流程，發(fā)現(xiàn)circ-ZNF609敲除后細(xì)胞增殖標(biāo)志物（CDK1和細(xì)胞周期蛋白A2）均顯著性降低，與此同時(shí)在小鼠成肌細(xì)胞中也觀察到類似的現(xiàn)象（圖4C）。另外，通過比較三種不同siRNAs（si-circ，si-ex2，si-mRNA）活性來驗(yàn)證初始篩選，熒光值顯示si-circ和si-ex2組成肌細(xì)胞的生長(zhǎng)率降低了80%，而si-mRNa僅針對(duì)線性mRNA而不影響增殖（圖4C-4D）。采用qRT-PCR分析ZNF609 RNA（周期進(jìn)展標(biāo)志物CDK1和Cyclin A2）表達(dá)水平來確認(rèn)三種siRNA的特異性（圖4E），進(jìn)一步說明表型變化具有非靶向效應(yīng)而增殖能力受circRNA活性影響。設(shè)計(jì)探針進(jìn)行Northern Blot分析，發(fā)現(xiàn)circ-ZNF609對(duì)si-circ治療敏感和RNase R耐藥，但ZNF609mRNA剛好與之相反（圖4F）。有趣的是，qRT-RCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在控制成肌細(xì)胞的肌生成過程中，circ-ZNF609表達(dá)量在WT組中下調(diào)而在DMD組中上調(diào)，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步加強(qiáng)了circ-ZNF609與成肌細(xì)胞增殖的聯(lián)系。
圖4 ?circ-ZNF609調(diào)控成肌細(xì)胞的增殖
[if !supportLists]5.?[endif]circ-ZNF609編碼過程與多聚體有關(guān)
從圖5A來看，circ-ZNF609來源于宿主基因第二外顯子的環(huán)化，其內(nèi)含一個(gè)753 nt的開放閱讀框（ORF），包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止密碼子（圖5A）。為了確定功能性，作者采用蔗糖梯度分餾測(cè)試circ-ZNF609在多聚體上的負(fù)載，并結(jié)合qRT-RCR分析得到?jīng)]有ORF的circRNA（circ-PMS1）停留在游離RNA組分上，circ-ZNF609沉淀在多組分中，且后者的沉積模式是由主動(dòng)翻譯引起的。另外在補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)中，核糖核酸酶R抗性結(jié)果證實(shí)了多聚體結(jié)合的circ-ZNF609RNA發(fā)生環(huán)狀構(gòu)象。
圖5 ?circ-ZNF609 RNA與多聚體有關(guān)
[if !supportLists]6.?[endif]circ-znf609具有蛋白質(zhì)編碼活性
如圖6A（P-Circ3XF結(jié)構(gòu)的示意圖）所示，構(gòu)建循環(huán)轉(zhuǎn)錄的表達(dá)載體測(cè)試circ-ZNF609的蛋白編碼能力。
對(duì)編碼蛋白進(jìn)行滴定檢測(cè)，結(jié)合WB檢測(cè)分析（圖6B）得到環(huán)狀模板產(chǎn)生的兩種亞型數(shù)量大致相同，但線性模板的翻譯強(qiáng)烈偏向于第一個(gè)ATG。為了進(jìn)一步證明染色體基因circ-ZNF609 RNA 的蛋白質(zhì)編碼能力，如圖6D所示，作者將33?FLAG編碼序列插入內(nèi)源性ZNF609，再通過質(zhì)譜檢測(cè)單個(gè)肽在蛋白質(zhì)序列上的映射位置（圖6E），最后確定circ-ZNF609編碼蛋白質(zhì)的過程。在正?；驘嵝菘藯l件下，用pcDNA或p-Circ3xf轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞并對(duì)蛋白質(zhì)的抗標(biāo)記抗體進(jìn)行WB分析，發(fā)現(xiàn)了熱休克誘導(dǎo)的標(biāo)記circ-ZNF609轉(zhuǎn)錄物被顯著地增強(qiáng)了翻譯過程（圖6G）。設(shè)計(jì)雙熒光素酶報(bào)告基因來測(cè)試circ-znf609是否具有IRES樣活性，結(jié)果顯示circ-znf609的UTR能夠以一種依賴于拼接的方式進(jìn)行IRES工作。
圖6 ?circ-znf609具有蛋白質(zhì)編碼活性
文章小結(jié)
本文作者采用體外分化的小鼠和人類成肌細(xì)胞進(jìn)行circRNAs表達(dá)譜分析，并鑒定了在肌發(fā)生過程中受到調(diào)控和在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良中發(fā)生改變的保守物種。高含量功能基因組篩選出與成肌細(xì)胞增殖特異性相關(guān)的circ-ZNF609，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其以一種剪接依賴和帽獨(dú)立的方式參與到真核生物的編碼蛋白過程。通過CRISPR/Cas9基因編輯獲得內(nèi)源性標(biāo)記等位基因的細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)circRNAs的翻譯活性低，有趣的是，熱休克時(shí)標(biāo)記circ-ZNF609翻譯的顯著激活，同時(shí)發(fā)現(xiàn)順式作用元件通過一個(gè)與帽無關(guān)的機(jī)制應(yīng)對(duì)不同的細(xì)胞應(yīng)力去啟動(dòng)翻譯。綜上所述，文獻(xiàn)中作者發(fā)現(xiàn)的circ-znf609為這類無帽和多聚腺苷尾轉(zhuǎn)錄物翻譯所需的因子提供了相關(guān)材料，在未來仍然有必要進(jìn)一步探究circRNA的功能機(jī)制。
解析文獻(xiàn)
Legnini I, Di Timoteo G,?Rossi F, et al. Circ-ZNF609 is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Mol Cell.?2017 Apr 6; 66(1): 22-37.
