?之前發(fā)過一個ATMT的綜述，這篇文章會有一些具體的操作方法【現(xiàn)學(xué)現(xiàn)賣】review農(nóng)桿菌介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化
Agrobacterium-MediatedTransformation of Fusarium oxysporum: An Efficient Tool for InsertionalMutagenesis and Gene Transfer(Mullins etal., 2001)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的尖孢鐮刀菌的轉(zhuǎn)化
簡介
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation (ATMT)）一直被用在植物細胞的轉(zhuǎn)化實驗中，這篇文章以尖孢鐮刀菌為例，構(gòu)建了4個雙載體系統(tǒng)，并且優(yōu)化了ATMT操縱真菌基因，構(gòu)造插入突變體的實驗條件。實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率受真菌孢子和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時期農(nóng)桿菌數(shù)量的影響最為顯著。
材料與方法
真菌材料
F. oxysporum strain O-685，在22℃下連續(xù)12d熒光燈照射，并使用CLA培養(yǎng)基（康乃馨葉片水瓊脂培養(yǎng)基，康乃馨葉片干燥，滅菌，撒在水瓊脂上。也可以用CMC或者綠豆培養(yǎng)基），誘導(dǎo)真菌分生孢子產(chǎn)生。用無菌水沖洗培養(yǎng)的菌落表面并用移液器收集，并用一種濾布Miracloth(CalbiochemBehring, La Jolla, CA)過濾掉大一些的菌絲體，獲得孢子懸浮液(1 ×106?conidia per ml)。
構(gòu)建載體
所有的載體都是在pCAMBIA1300 (CAMBIA, Canberra,Australia)載體的基礎(chǔ)構(gòu)建的。（結(jié)果表明基礎(chǔ)載體和改造的都可以在尖孢鐮刀菌中起作用。這篇文章中用的載體比以前研究用的pUR5750，14kb小了很多）
（1）pBHt1（8.4kb）載體：用BamHI和HindIII酶切pCSN44質(zhì)粒，獲得1.4kb大小，攜帶潮霉素B抗性基因（hygromycinB resistance (hph) gene）和構(gòu)巢曲霉trpC啟動子的插入片段。而基礎(chǔ)pCAMBIA1300載體則如圖箭頭所示，用XhoI和BstXI酶將這部分切除，接合（ligate）上述插入片段，最終得到pBHt1（8.4kb）載體。
（2）pDHt（7.1kb）載體：將基礎(chǔ)載體按照（1）的兩個酶作用后，得到的片段在沒有插入片段的情況下自我連結(jié)（self-ligate）。
（3）pBHt2（8.4kb）載體：與（1）類似，但是插入序列是從pCB1004質(zhì)粒里獲得的。
（4）pKHt（10.6kb）載體：2.2kb大小的片段包含ColE1復(fù)制起點（replicationof origin）和氯霉素抗性（ferringchloramphenicol resistance）基因。這段序列是通過特異性引物ECO-1和PST-1擴增pBCSK (Stratagene, La Jolla, CA)得到的。在pBHt2的基礎(chǔ)上，插入的位置是MCS（Themultiple cloning site，MCS包含EcoRI,SacI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI, 和HindIII等位點）。
轉(zhuǎn)化
（1）包含合適的雙載體的農(nóng)桿菌Agrobacteriumtumefaciens strain?AGL-1在28℃，包含卡那霉素（kanamycin，50μg/ml）的MM培養(yǎng)基（Minimalmedium(g/L)：K2HP04, 2.05; KH2P04,1.45; NaCI, 0.15; MgSO4.7H20, 0.50; CaCI2.6H20,? 0.1; FeSO4.7H20, 0.0025;(NH4)2S04, 0.5）中生長2d。
（2）將農(nóng)桿菌細胞在IM培養(yǎng)基（inductionmedium: MM salts, 40 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES), pH 5.3, 10mM glucose, 0.5% (w/v) glycerol, 200 μM AS）中稀釋到OD600= 0.15，繼續(xù)培養(yǎng)6h。（結(jié)果顯示前培養(yǎng)時AS不是必需的）
（3）然后將農(nóng)桿菌菌液與上述制備的孢子懸浮液1：1混合。200μl混合液平鋪在消化纖維素濾紙（nitrocellulosefilter）上，濾紙放在在共培養(yǎng)平板上，所用培養(yǎng)基和IM唯一的差別是glucose含量為10 mM。25℃培養(yǎng)2d。
（4）濾紙轉(zhuǎn)移到含有hygromycinB (75 μg/ml)，cefotaxime (200 μM)和moxalactum (100 μg/ml)的MM培養(yǎng)基。
（5）獲得的真菌轉(zhuǎn)化子分別獨立的轉(zhuǎn)移到24孔板里，孔里含有CLA和hygromycin B (75 μg/ml)，培養(yǎng)至產(chǎn)孢。
（6）獨力轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的孢子在水中稀釋，涂布在含有hygromycin B (75 μg/ml)的PDA上。獲得單孢菌落。并且通過多代無抗生素培養(yǎng)，隨后再次接種在含有抗生素培養(yǎng)基上的方法，檢測轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定性（文章結(jié)果是6代仍遺傳穩(wěn)定）。
Transformation ofConiothyrium minitans, a parasite of Sclerotinia sclerotiorum, withAgrobacterium tumefaciens(Li et al.,2005)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將盾殼霉轉(zhuǎn)入到核盤菌
這個文章同樣用到了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，但是因為實驗真菌不同，這個文章在前一篇的基礎(chǔ)上，更改了真菌培養(yǎng)溫度，時間；真菌孢子濃度（107?spores/ml）；孢子和農(nóng)桿菌共培養(yǎng)時AS濃度400μM。以及一系列抗生素的濃度都根據(jù)材料有所變化。
參考文獻
Li, M., Gong, X., Zheng, J.,Jiang, D., Fu, Y., and Hou, M. (2005) Transformation of Coniothyrium minitans,a parasite of Sclerotinia sclerotiorum, with Agrobacterium tumefaciens.?FEMS microbiology letters?243: 323-329.
Mullins, E.D., Chen, X., Romaine,P., Raina, R., Geiser, D.M., and Kang, S. (2001) Agrobacterium-mediatedtransformation of Fusarium oxysporum: an efficient tool for insertionalmutagenesis and gene transfer.?Phytopathology91: 173-180.
