1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與技術(shù)路線

(1) 常用流程

(2) 樣品

(3) iTRAQ/TMT項(xiàng)目設(shè)計(jì)
體外等重同位素標(biāo)記定量技術(shù)，可同時(shí)比較多個(gè)樣本之間的蛋白表達(dá)量差異（通常10個(gè)樣本以下）。
基本原則：

• 適用較廣，但樣本間需要較好的平行性，不適合進(jìn)行不同物種樣本間比較，如牛、羊、豬之間的比較；也不適合一些差異較大的IP樣品的比較。
• 一般差異比較樣本組用同一個(gè)試劑盒標(biāo)記；
• 建議3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；對(duì)于臨床樣本、小鼠等動(dòng)物樣本、植物樣本等，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)建議來(lái)自多個(gè)生物個(gè)體的重復(fù)；
• 多個(gè)試劑盒項(xiàng)目設(shè)計(jì)時(shí)，可加入內(nèi)標(biāo)（IS），內(nèi)標(biāo)通常是所有樣本等量混合的樣本。

(4) Labelfree項(xiàng)目設(shè)計(jì)
Labelfree是通過(guò)比較肽段母離子質(zhì)譜峰強(qiáng)度，分析不同來(lái)源樣品蛋白的表達(dá)量差異。該技術(shù)無(wú)需昂貴的同位素標(biāo)記做內(nèi)標(biāo)。
基本原則：

• 適用于各類型生物樣本；尤其是樣本量較少或差異非常大的樣品，如細(xì)胞上清、亞細(xì)胞成分、IP樣品等的分析；
• 對(duì)于組間差異大的樣品，可采用iBAQ算法（MaxQuant）來(lái)反映一個(gè)樣品內(nèi)不同蛋白間的相對(duì)豐度，可進(jìn)行不同物種樣品間的比較，如牛、羊、豬之間的比較；
• 適合多組分析、后期差異比較組可能會(huì)改變的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；
• 建議3個(gè)生物學(xué)重復(fù)；對(duì)于臨床樣本、小鼠等動(dòng)物樣本、植物樣本等，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)建議來(lái)自多個(gè)生物個(gè)體的重復(fù)。

（5）DIA項(xiàng)目設(shè)計(jì)
DIA是數(shù)據(jù)非依賴性采集定量技術(shù)，它將質(zhì)譜整個(gè)全掃描范圍分為若干個(gè)窗口，高速循環(huán)地對(duì)每個(gè)窗口中的所有離子進(jìn)行選擇、碎裂及檢測(cè)，從而無(wú)遺漏、無(wú)差異地獲取樣本中所有離子的全部碎片信息。DIA無(wú)需指定目標(biāo)肽段，掃描點(diǎn)數(shù)均勻，利用譜圖庫(kù)即可實(shí)現(xiàn)定性確證和定量離子篩選，并可實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)回溯。
基本原則：

• 適用于各類型生物樣本；
• 需要先進(jìn)行l(wèi)ibrary構(gòu)建；
• 適合多組分析、后期差異比較組可能會(huì)改變的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；
• 建議獨(dú)立的大樣本分析。

（6）各定量技術(shù)比較
從數(shù)據(jù)采集模式來(lái)說(shuō)，iTRAQ/TMT和Labelfree都是傳統(tǒng)的DDA掃描，即在每個(gè)掃描周期內(nèi)，只采集豐度最高的10-20個(gè)母離子信號(hào)的子離子碎片，其他信號(hào)的子離子信息丟失，因此覆蓋率低、隨機(jī)性高、重復(fù)性相對(duì)低；DIA掃描則在每個(gè)掃描周期內(nèi)，將質(zhì)量區(qū)間設(shè)置為多個(gè)區(qū)段window，每次采集window內(nèi)所有母離子信息及其碎片（掃描速度足夠快），因此具有高覆蓋度、高重復(fù)性的特點(diǎn)。

（7）搜庫(kù)軟件

流程回顧：
蛋白質(zhì)酶切為肽段，經(jīng)過(guò)色譜分離進(jìn)入質(zhì)譜儀，得到質(zhì)譜實(shí)際譜圖，利用搜庫(kù)軟件與理論譜圖進(jìn)行匹配打分，對(duì)肽段和蛋白進(jìn)行鑒定、定量和下游數(shù)據(jù)分析。

• Mascot
  特點(diǎn)：收費(fèi)；基于隨機(jī)匹配打分算法；整合FDR閾值和Percolator算法；質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索的黃金標(biāo)準(zhǔn)。
• MaxQuant
  特點(diǎn)：免費(fèi)不開(kāi)源；優(yōu)勢(shì)在labelfree，RT校正，Match between runs提高鑒定數(shù)；配套的后處理工具Perseus。
• Spectronaut
  特點(diǎn)：收費(fèi)；相對(duì)其他DIA軟件，準(zhǔn)確性高、靈敏度高、速度快；實(shí)現(xiàn)超過(guò)1000個(gè)DIA原始文件同時(shí)分析，極高譜圖解析率，數(shù)據(jù)校正平均峰面積CV<10%；蛋白FDR、肽段FDR和CScore三重標(biāo)準(zhǔn)。

2. 質(zhì)量控制

（1）色譜質(zhì)控

• 色譜的峰形，決定定量準(zhǔn)不準(zhǔn)
  對(duì)稱？拖尾？
• 色譜的數(shù)據(jù)點(diǎn)，決定定量準(zhǔn)不準(zhǔn)
  峰曲線上點(diǎn)多？少？
• 色譜的穩(wěn)定性，決定定量準(zhǔn)不準(zhǔn)
  RT是否偏移？使用iRT同位素內(nèi)參校正色譜偏移
• 色譜的分離度，決定質(zhì)譜的采集效率
  （2）質(zhì)量控制
• 基礎(chǔ)狀態(tài)考察
  牛血清白蛋白（BSA）：考察質(zhì)量偏移、洗脫時(shí)間、峰寬、信號(hào)響應(yīng)等；
  細(xì)胞樣品：考察組學(xué)能力，如負(fù)責(zé)樣品蛋白和肽段數(shù)目鑒定能力。
• 復(fù)雜樣本鑒定重現(xiàn)性
  三次重復(fù)鑒定的肽段DDA在60%以上，DIA在90%以上；
  三次重復(fù)鑒定的蛋白DDA在70%以上，DIA在90%以上；
• QC樣本
  一般是將所有樣本等量混合成QC樣本。前后QC，中間每10個(gè)樣加一個(gè)QC。
  統(tǒng)計(jì)分析QC樣本的CV分布、聚類、相關(guān)性分析、PCA得分、質(zhì)譜穩(wěn)定性。
  （3）質(zhì)控目標(biāo)
• 全
  鑒定數(shù)目多，覆蓋率高。
• 穩(wěn)
  鑒定重現(xiàn)性高，穩(wěn)定性好，尤其是大樣本的檢測(cè)。
• 準(zhǔn)
  定量準(zhǔn)確性高。

3. 下游分析

進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，可從以下角度來(lái)分析：

• 哪些蛋白質(zhì)？

• 豐度如何？

• 有何功能？

• 在哪里作用？

• 是否或如何互作？

• 結(jié)構(gòu)？
  鑒定層面就不再贅述，只補(bǔ)充下搜庫(kù)的數(shù)據(jù)庫(kù)選擇。一是綜合性蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，如NCBI、Uniprot、Ensembl等；二是特定物種的蛋白庫(kù)，如擬南芥（TAIR）、水稻（RAPDB）、家蠶（silkdb）等；三是針對(duì)非模式生物，由已測(cè)序結(jié)果翻譯而來(lái)的蛋白序列數(shù)據(jù)。
  （1）定量層面

• 定量數(shù)據(jù)概括
  a. 表達(dá)量層次聚類熱圖：
  在相似性的基礎(chǔ)上對(duì)數(shù)據(jù)分組、歸類。一般組內(nèi)的數(shù)據(jù)模式相似性較高，組間相似性較低。
  b. 樣品組間表達(dá)譜相關(guān)性分析：
  樣本相關(guān)性熱圖。
  c. PCA 分析：
  多個(gè)變量綜合定量比較考察。
  對(duì)高維數(shù)據(jù)降維，減少?gòu)?fù)雜性，對(duì)樣本進(jìn)行分類及預(yù)測(cè)，易于解釋，分離信號(hào)和噪音，數(shù)據(jù)可視化。

• 趨勢(shì)聚類分析
  即將蛋白根據(jù)表達(dá)趨勢(shì)進(jìn)行歸類。趨勢(shì)聚類后，可以結(jié)合層次聚類、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析、功能分類、信號(hào)通路分類或染色體分析等方法進(jìn)行更深入的挖掘，適合最佳時(shí)間、最佳濃度、最佳溫度等的選擇。

• 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
  差異蛋白篩選：

（2）功能層面

• 亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)
  生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)必須要運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞的特定位置才能發(fā)揮生物學(xué)功能。研究未知蛋白生物學(xué)功能的第一步通常是獲得蛋白亞細(xì)胞定位信息。
  傳統(tǒng)的電子顯微法、熒光顯微法等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果準(zhǔn)確但費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此可通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)算法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。
  在線工具：
  CELL：http://cello.life.nctu.edu.tw/

• 功能分析
  根據(jù)相似性原理，具有相似序列的蛋白也可能具有相似的功能，因此將blast所得的相似蛋白的功能信息轉(zhuǎn)嫁到目標(biāo)蛋白上，可輔助對(duì)于目標(biāo)蛋白尤其是研究程度不足的物種的目標(biāo)蛋白的功能注釋。
  GO（Gene Ontology）基因功能標(biāo)準(zhǔn)化詞匯術(shù)語(yǔ)，三大本體BP，CC，MF。
  BlastGO大規(guī)模注釋GO。
  注釋是一個(gè)評(píng)判打分的過(guò)程，這個(gè)打分系統(tǒng)會(huì)綜合考量目標(biāo)序列和比對(duì)序列的相似性、GO條目來(lái)源的可靠度以及GO有向無(wú)環(huán)圖的結(jié)構(gòu)，只有滿足預(yù)設(shè)分?jǐn)?shù)的GO term才會(huì)被注釋給目標(biāo)蛋白序列。
  保守motif預(yù)測(cè)：通過(guò)InterProscan搜索EBI數(shù)據(jù)庫(kù)中與目標(biāo)蛋白匹配的保守基序（motif），并將motif相關(guān)的功能信息注釋給目標(biāo)蛋白序列。
  在線工具：Motif-x：http://motif-x.med.harvard.edu/

• 通路分析
  KEGG Pathway共7大類。介紹略
  多通路整合——>發(fā)現(xiàn)分子調(diào)控機(jī)制。

• 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)
  在生物體中，蛋白質(zhì)并非孤立存在的，其功能的行使必須借助于其他蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)和介導(dǎo)。這種調(diào)節(jié)或介導(dǎo)作用的實(shí)現(xiàn)首先要求蛋白質(zhì)之間有結(jié)合作用或相互作用。
  蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)對(duì)于揭示蛋白功能具有重要意義。例如，高度聚集的蛋白質(zhì)可能具有相同或相似的功能；連接度高的蛋白質(zhì)可能是影響整個(gè)系統(tǒng)代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵點(diǎn)。
  分析工具：IntAct、MINT、String、Cytoscape......
  術(shù)語(yǔ)：edge、node、cluster、degree、module.......