2014/10/30
毫無疑問，提高生物學(xué)重復(fù)或提高單個(gè)樣本測(cè)序量，都可以改善這些問題。但在研究經(jīng)費(fèi)有限的情況下，“提高生物學(xué)重復(fù)數(shù)而降低單個(gè)樣本的測(cè)序量”或“提高單個(gè)樣本測(cè)序量而降低生物學(xué)重復(fù)”，哪個(gè)更有效？
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在RNA-seq項(xiàng)目設(shè)計(jì)過程中，老師經(jīng)常會(huì)問兩個(gè)問題：
1）低豐度的基因是否能夠被檢測(cè)到（有或無）；
2）基因定量的結(jié)果是否準(zhǔn)確（高或低）；
毫無疑問，提高生物學(xué)重復(fù)或提高單個(gè)樣本測(cè)序量，都可以改善這些問題。但在研究經(jīng)費(fèi)有限的情況下，“提高生物學(xué)重復(fù)數(shù)而降低單個(gè)樣本的測(cè)序量”或“提高單個(gè)樣本測(cè)序量而降低生物學(xué)重復(fù)”，哪個(gè)更有效？
我們經(jīng)常會(huì)建議老師：“3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本（2G/樣本）的定量準(zhǔn)確性 大于 單個(gè)樣本6G數(shù)據(jù)量。即相同的總數(shù)據(jù)量拆分到更多的生物學(xué)重復(fù)中，實(shí)際上定量可靠性是提高了?！边@個(gè)結(jié)論的出處是哪里？ 下面，我們通過一篇參考文獻(xiàn)解答這個(gè)問題。
背景：這篇2012年 BMC genomiss的方法學(xué)文章，主要討論了生物學(xué)或技術(shù)重復(fù)、單樣本測(cè)序量、分析算法這3類因素對(duì)RNA表達(dá)差異分析的影響；
結(jié)論：
1）軟件DESeq的效果優(yōu)于edgeR或NBPSeq。
2）差異分析對(duì)數(shù)據(jù)量并不敏感，甚至當(dāng)單個(gè)樣本測(cè)序量降低為原來的15%的時(shí)候，也不會(huì)大幅度降低差異基因檢出率。
3）增加生物學(xué)重復(fù)對(duì)提高表達(dá)差異分析結(jié)果可靠性的效果要優(yōu)于單樣本測(cè)序量，
備注：第二、三部分的內(nèi)容，我們將在下文重點(diǎn)解讀。
判定差異分析結(jié)果可靠性的指標(biāo)
假陽性與真陽性
直觀一些說，如果某個(gè)基因在RNA-seq結(jié)果顯示差異表達(dá)，但Qpcr結(jié)果表明這個(gè)基因表達(dá)差異不顯著，可以認(rèn)為這個(gè)基因RNA-seq結(jié)果為假陽性；反之，這個(gè)結(jié)果就是真陽性。
而老師往往會(huì)關(guān)心某些低表達(dá)基因的表達(dá)差異變化能否被正確檢測(cè)，那么這就要求我們提高實(shí)驗(yàn)的真陽性率。
假陽性率（FPR）：真實(shí)非差異表達(dá)中的基因中，被錯(cuò)誤判定為差異表達(dá)的比例，F(xiàn)DR越低越好；
真陽性率（TPR）：真實(shí)差異表達(dá)的基因中，能夠正確判定為差異表達(dá)的比例，TPR越高越好；真陽性率這個(gè)概念，如果換用為“差異基因的檢出率”更容易理解，下文我們會(huì)并用這兩個(gè)概念。
下文，我們將重點(diǎn)摘抄文章中三個(gè)方面的問題，并做總結(jié)：
1. 生物學(xué)重復(fù)對(duì)差異表達(dá)分析的影響
如表1所示，在單樣本測(cè)序量保持不變的情況下，隨著生物學(xué)重復(fù)數(shù)（n）的提高，差異分析的假陽性率（FPR）基本穩(wěn)定，但真陽性率（TPR）在不斷提高。也就是說提高生物學(xué)重復(fù)數(shù)，實(shí)驗(yàn)對(duì)差異表達(dá)基因的檢測(cè)更加敏感，那些差異倍數(shù)較小或表達(dá)量較低的差異表達(dá)基因（此類基因的差異檢測(cè)難度較大）能夠更容易被檢測(cè)到。
2. 單樣本測(cè)序量對(duì)差異表達(dá)分析的影響
如表2、表3所示，在一定的生物學(xué)重復(fù)數(shù)（n）的情況下，隨著單樣本測(cè)序量（Depth）的提高（25% → 100%），假陽性率（FDR）和真陽性率（TPR）都只有有限的提高。例如在n=3的情況下，單個(gè)樣本的測(cè)序量從25%提高到100%，F(xiàn)DR僅僅從0.02%提高到0.04%，TPR僅僅從6.24%提高到8.95%。
在表3中，如果Depth等于25%不變，當(dāng)n從2提高到12，TPR的提高則是非常明顯的。因此測(cè)序深度對(duì)結(jié)果改善效果并不如增加生物學(xué)重復(fù)。在下文，我們將詳細(xì)比較。
2.1總數(shù)據(jù)量不變，生物學(xué)重復(fù)數(shù)與單樣本測(cè)序量最佳組合
不同單樣本測(cè)序量與生物學(xué)重復(fù)數(shù)組合，對(duì)應(yīng)的TPR變化
如果保持總測(cè)序量不變（即如果生物學(xué)重復(fù)數(shù)為n，則單個(gè)樣本的測(cè)序量降低為1/n，總數(shù)據(jù)量為n×1/n=1 ，保持不變）。
如圖1（a），灰色實(shí)線代表不同生物學(xué)重復(fù)數(shù)（n）和單樣本數(shù)據(jù)量（1/n）組合的情況下，真陽性率（TPR）的變化。結(jié)果表明，隨著n的提高，TPR率不斷提高。例如，如果n=2，TPR約為3%，如果n=6，TPR則提高到22%
2.2總數(shù)據(jù)量不變，生物學(xué)重復(fù)數(shù)與測(cè)序量最佳組合
如果n=3固定不變，單個(gè)樣本數(shù)據(jù)量降低，TPR的變化
2.3總數(shù)據(jù)量不變，生物學(xué)重復(fù)數(shù)與測(cè)序量最佳組合
不同測(cè)序量與生物學(xué)重復(fù)數(shù)組合，對(duì)應(yīng)的FPR變化
但是不同的生物學(xué)重復(fù)數(shù)和單樣本測(cè)序量的組合，對(duì)假陽性率（FPR）的影響卻較小。如圖1（b），灰色實(shí)線代表不同生物學(xué)重復(fù)數(shù)（n）和單樣本數(shù)據(jù)量（1/n）組合的情況下，真陽性率（FPR）的變化。雖然n從2變化到96，F(xiàn)PR基本沒有太大變化。
從圖中我們很容易發(fā)現(xiàn)，基于負(fù)二項(xiàng)分布的差異分析檢驗(yàn)（P value），F(xiàn)PR對(duì)生物學(xué)重復(fù)數(shù)和單個(gè)樣本數(shù)據(jù)量均不敏感，始終保持低于0.1%水平?；蛘哒f，這個(gè)算法對(duì)FPR的控制還是非常理想的。
討論
1. RNA-seq老師關(guān)心的問題 ：
1）低豐度的基因是否能夠被檢測(cè)到（有或無）；
2）基因定量的結(jié)果是否準(zhǔn)確（高或低）；
大部分老師對(duì)第一個(gè)問題的關(guān)心程度要大于第二個(gè)，第二個(gè)問題常常被忽略。
但實(shí)際上，隨著測(cè)序單價(jià)的下降，目前市場(chǎng)上RNA-seq類項(xiàng)目的單樣本測(cè)序量正在不斷提高。以2G，PE100測(cè)序的表達(dá)譜項(xiàng)目為例，其對(duì)應(yīng)的測(cè)序量為20M條reads。如果一條長(zhǎng)度為1kbp的低表達(dá)基因的表達(dá)量為RPKM=0.5，其理論上可以檢測(cè)到的reads數(shù)為20×0.5=10。所以低豐度基因的檢測(cè)，對(duì)RNA-seq這個(gè)技術(shù)來說并非最大問題。
如上圖，大部分RNA-seq類項(xiàng)目，老師都會(huì)看到測(cè)序的飽和曲線達(dá)到平臺(tái)期。也就是說再增加測(cè)序量，新檢測(cè)出的基因數(shù)并不會(huì)有明顯增加。
第二個(gè)問題“轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量的高低變化”比“轉(zhuǎn)錄本的有無”更具有普遍的生物學(xué)意義。雖然個(gè)別基因的表達(dá)量變化程度，可以使用Qpcr來驗(yàn)證。但我們往往也使用所有差異基因來統(tǒng)計(jì)某些規(guī)律。例如使用差異基因的pathway富集分析來尋找與性狀相關(guān)的pathway。如果在全局水平的差異基因集并不可靠，那么pathway富集分析得出的結(jié)論的可靠性自然也受到影響。而全局水平的差異基因數(shù)量巨大，是難以使用Qpcr驗(yàn)證的。
因此，定量以及差異分析的準(zhǔn)確性是在RNA-seq中更值得老師關(guān)心的問題。在討論的第二部分，我們重點(diǎn)展開敘述。
2. 重復(fù)數(shù)、單樣本測(cè)序量的取舍
我們將前文提到的三個(gè)問題在進(jìn)行總結(jié)：
1）生物學(xué)重復(fù)對(duì)差異表達(dá)的影響；
目前，主流期刊對(duì)生物學(xué)重復(fù)慢慢會(huì)有一定的要求。從本文，我們可以看到，設(shè)定生物學(xué)重復(fù)對(duì)差異基因的檢出率（真陽性率，TPR）的提高具有明顯效果。所以，設(shè)定生物學(xué)重復(fù)對(duì)提高結(jié)果的可靠性，是非常有意義的。
2）單個(gè)樣本的測(cè)序量
老師對(duì)測(cè)序量比較關(guān)心，主要還是由于擔(dān)心低豐度基因無法檢測(cè)的問題。討論的第一部分，我們也解釋過，目前RNA-seq 的數(shù)據(jù)量（一般不低于2G，對(duì)于lncRNA測(cè)序，數(shù)據(jù)量一般更大）已經(jīng)足以保證大部分低豐度基因的檢測(cè)。而且，從本文我們可以看到，在其他條件不變的情況下，單樣本數(shù)據(jù)量從100%降低到15%，差異基因的檢出率（真陽性率，TPR) 降低較為平緩。所以，單樣本數(shù)據(jù)量對(duì)RNA-seq定量和差異分析的影響實(shí)際上是十分有限的。
3）總數(shù)據(jù)量不變，生物學(xué)重復(fù)數(shù)與單樣本測(cè)序量最佳組合
由于大部分老師科研經(jīng)費(fèi)有限，無法無限制地增加樣本數(shù)或數(shù)據(jù)量。所以在生物學(xué)重復(fù)數(shù)和單個(gè)樣本測(cè)序量上必須找到平衡點(diǎn)。從本文我們可以看出，在總數(shù)據(jù)量不變的情況下，將總數(shù)據(jù)量分配到更多的生物學(xué)重復(fù)樣本中，差異分析結(jié)果的可靠性在不斷提升。這也與前兩點(diǎn)得出的結(jié)論一致——對(duì)于RNA-seq，生物學(xué)重復(fù)數(shù)的價(jià)值要大于單個(gè)樣本測(cè)序量。
但增加生物學(xué)重復(fù)的樣本數(shù)，意味著要增加建庫費(fèi)用。因此，即使總數(shù)據(jù)不變，設(shè)置過多的生物學(xué)重復(fù)也是不合理的。一般而言，設(shè)定3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，依然是最高性價(jià)比的選擇。
3. 其他
增加單樣本數(shù)據(jù)量對(duì)定量的改良是有限的。但對(duì)于低豐度 轉(zhuǎn)錄本de novo拼接（無參考基因組）或低豐度新轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)（有參考基因組），更高的數(shù)據(jù)量的確可以潛在改善拼接效果。
那么對(duì)于此類情況，我們可以采取以下策略：1）在拼接的步驟，我們可以將所有數(shù)據(jù)合并（例如每個(gè)生物學(xué)重復(fù)2G數(shù)據(jù)量，3個(gè)重復(fù)，全部合并），足夠大的數(shù)據(jù)量來保證拼接效果；2）完成拼接后，在定量這個(gè)步驟，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本獨(dú)立定量。從而，可以在控制整個(gè)項(xiàng)目測(cè)序量的情況下，兼顧轉(zhuǎn)錄本拼接和定量這兩個(gè)方面的問題。
這個(gè)策略也可以解釋，對(duì)于lncRNA測(cè)序，如果不設(shè)置重復(fù)，我們建議老師單樣本測(cè)序量為810G。如果設(shè)置了重復(fù)，而老師經(jīng)費(fèi)有限，那么可以將單個(gè)樣本的數(shù)據(jù)量降低（例如56G），其效果依然要優(yōu)于不設(shè)置重復(fù)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
