姓名：王成? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?學(xué)號(hào)：16140110062
學(xué)院：微電子學(xué)院
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【嵌牛導(dǎo)讀】：Nature子刊發(fā)表中科院腦智卓越中心關(guān)于新型RNA編輯工具開(kāi)發(fā)及其優(yōu)化的研究成果
【嵌牛鼻子】：新型RNA編輯工具
【嵌牛提問(wèn)】：新型RNA編輯工具在生物學(xué)上的應(yīng)用有什么進(jìn)展？
【嵌牛內(nèi)容】：
? ? 最近報(bào)導(dǎo)的Cas13系統(tǒng)都是從可培養(yǎng)的微生物基因組數(shù)據(jù)中挖掘的，然而自然界中90%的微生物都是不可培養(yǎng)的，因此，楊輝團(tuán)隊(duì)這次把目標(biāo)聚焦在挖掘未獲培養(yǎng)的自然微生物宏基因組數(shù)據(jù)。該研究通過(guò)精巧的計(jì)算生物學(xué)算法和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，鑒定到了兩個(gè)新的Cas13家族，并命名為Cas13X和Cas13Y，其中，Cas13X.1蛋白比常用的RfxCas13d蛋白還要小將近200個(gè)氨基酸，為目前最小的Cas13蛋白。通過(guò)對(duì)大量?jī)?nèi)源基因位點(diǎn)進(jìn)行敲低實(shí)驗(yàn)，Cas13X.1展現(xiàn)了和RfxCas13d一樣的高活性和高特異性。
? 為進(jìn)一步研究Cas13X.1在抗RNA病毒方面的應(yīng)用潛力，團(tuán)隊(duì)成員分別對(duì)H1N1病毒和過(guò)表達(dá)的部分新冠病毒基因組上多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行靶向切割，發(fā)現(xiàn)Cas13X.1在體外展現(xiàn)了良好的病毒抑制效果。最后，楊輝團(tuán)隊(duì)將突變的Cas13X.1與ADAR2dd進(jìn)行融合，并做了一系列蛋白截短改造，開(kāi)發(fā)了一種迷你型的RNA單堿基編輯工具，通過(guò)與之前報(bào)道的RNA單堿基編輯系統(tǒng)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，基于迷你型Cas13X.1蛋白的RNA單堿基編輯系統(tǒng)（miniCas13X-ADAR2dd）可以對(duì)靶RNA進(jìn)行高效的A到I和C到U的編輯。同時(shí)，miniCas13X-ADAR2dd比REPAIR和RESCUE系統(tǒng)小將近900aa，可以包裝到一個(gè)AAV里面。此外，全轉(zhuǎn)錄組分析顯示，迷你堿基編輯器脫靶活性極低，是一項(xiàng)高保真的堿基編輯技術(shù)。
? 值得一提的是，目前Cas13系統(tǒng)應(yīng)用于臨床最大的障礙是Cas13蛋白本身的旁切活性(collateralactivity,靶RNA激活的非靶標(biāo)RNA切割活性)。已有證據(jù)表明Cas13d的旁切活性會(huì)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞和個(gè)體產(chǎn)生一定毒副作用。雖然Cas13X.1在體外切割實(shí)驗(yàn)中顯示了比Cas13a和Cas13d更低的旁切活性，但是Cas13X.1的進(jìn)一步改進(jìn)，以及體內(nèi)的長(zhǎng)期安全性評(píng)價(jià)，對(duì)于Cas13X.1的最終臨床應(yīng)用至關(guān)重要。
? ?該工作成功從未獲培養(yǎng)微生物宏基因組數(shù)據(jù)中鑒定到了兩個(gè)新的Cas13系統(tǒng)，極大地豐富了Cas13家族的多樣性。而且通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證明了Cas13X.1在RNA編輯方面具有非常大的應(yīng)用潛力，小尺寸很好地解決了Cas13體內(nèi)遞送的問(wèn)題，有望在未來(lái)成為一種高效安全的RNA治療方法，為疾病(尤其是罕見(jiàn)病)的基因治療提供更多的選擇。
? 該項(xiàng)工作由中科院腦智卓越中心博士后胥春龍、周英思和博士研究生肖慶全、博士后賀冰冰與耿冠男等研究人員，在中科院腦智卓越中心楊輝研究員、周英思博士和中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院賴錦盛教授的指導(dǎo)下完成，研究組的博士后汪子康、董雪、研究生曹碧蓉和本科生王一凡等其他成員積極參與，并得到了腦智卓越中心流式分選和高性能計(jì)算集群平臺(tái)的大力協(xié)助。本工作得到科技部、中科、國(guó)家基金委、上海市的資助。
? 圖1：從未獲培養(yǎng)的自然微生物宏基因組數(shù)據(jù)挖掘新的Cas13蛋白應(yīng)用于哺乳動(dòng)物與病毒RNA的敲降。a,?構(gòu)建新挖掘的Cas13X, Cas13Y蛋白與前人報(bào)道的Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d蛋白的進(jìn)化樹(shù)。括號(hào)展示了常見(jiàn)的Cas13蛋白及其大小。標(biāo)尺展示了大小為0.5的相對(duì)遺傳距離。b,?Cas13X與Cas13Y相關(guān)CRISPR系統(tǒng)的基因座示意圖。藍(lán)色和綠色長(zhǎng)方形分別表示Cas13和CRISPR重復(fù)單元。灰色菱形表示間隔序列。c,Cas13X.1介導(dǎo)高效的多重RNA敲降。d,?上, SARS-CoV-2與SARS-CoV-1以及 SARS-CoV-2 與所有冠狀病毒基因組序列的比對(duì)結(jié)果. 中, SARS-Cov-2病毒RNA敲降的報(bào)告系。下, 病毒RNA敲降結(jié)果。
? 圖2：開(kāi)發(fā)基于Cas13X.1的迷你型RNA堿基編輯器應(yīng)用于高效的A到I和C到U堿基替換 a,?基于dCas13X.1的RNA腺苷酸編輯器xABE以及堿基編輯報(bào)告系統(tǒng)示意圖。b,?預(yù)測(cè)的Cas13X.1 與ADAR2dd蛋白結(jié)構(gòu)。黃色和綠色分別表示Cas13X.1的N端與C端, 紅色代表HEPN基序, 橙色表示ADAR2dd。c,xABE截短突變體的效率檢測(cè)結(jié)果。d,全長(zhǎng)與迷你xABE及過(guò)去報(bào)道的ABE的A到I編輯效率的比較結(jié)果。e,全長(zhǎng)與迷你xCBE及過(guò)去報(bào)道的CBE的C到U編輯效率的比較結(jié)果。f,迷你xABE/xCBE顯著降低全轉(zhuǎn)錄組的RNA脫靶編輯。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41592-021-01124-4
