該方案是簡單而且得到廣泛應用的、利用PCR 模板制備雙鏈RNA 的體外轉錄反應。該方法制備的dsRNA 可以用于在某些細胞或者組織中誘發(fā)RNA 干擾。
試劑
瓊脂糖凝膠( 1 %)
復性緩沖液( 10 X)
ATP 、CTP 、GTP 、UTP （ 每種100mmol/L )
二硫蘇糖醇( DTT ) ( 1mol/L)
DNA 分子質量標準
dNTP 混合液，每種10mmol/L
乙醇( 100％和70%)
Ficoll-Orange G 上樣緩沖液( 6 X)
非變性凝膠上樣緩沖液( 10 X)
無核酸酶水
寡核昔酸引物
PCR 緩沖液( 10 X)
酚： 氯仿( 1 : 1,VIV)
無RNA 酶的胰腺DNA 酶Ⅰ ( 2U/μL)
乙酸鈉( 3mol/L , pH 5.2 )
SYBR Gold ( 10000 X) 或者溴化乙錠（10mg/mL)
T7RNA 聚合酶( 20U/ μL)
T7 轉錄緩沖液（10 X)
TAE 緩沖液( 50 X , 1 X)
Taq DNA 聚合酶( 2.5U/μL)
TBE 緩沖液( 5 X , 0.5 X)
PCR 用DNA 模板
設備
瓊脂糖凝膠電泳儀
離心機
微量離心管(1.5m.L)
PCR 管(0.5mL, 薄壁）
Primer3 軟件
分光光度計
熱循環(huán)儀
渦旋振蕩器
方法
制備體外轉錄用DNA 模板
1 在有關的數據庫或者根據序列數據，分析目的基因的mRNA 、cDNA 或者基因組序列。
2 選擇長度為500~800bp 的靶區(qū)域作為dsRNA 模板。
3 利用BLASTn 有義鏈和反義鏈進行同源性分析。如果某條鏈與非目的靶基因同源，則重復步驟2 。
4. 用Primer3 軟件設計長度為20 ~ 24 個核昔酸的正向和反向引物，使其Tm值約為60°C（http://primer3.sourceforge.net/) 。
5. 將T7 啟動子序列( 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′) 加到兩條引物的5’端。需要準備帶有或者不帶有T7 啟動子序列的正向和反向引物（兩對引物） 。
6 分別進行兩套PCR 反應，生成RNA 有義鏈和反義鏈所使用的DNA 模板。每生成一個DNA 模板，需要將下列試劑在 1.5mL 試管中配制成一個500μL 的PCR 體系：
模板DNA—a
無核酸酶水加至395μL
PCR 緩沖液( 10 X)50μL
dNTP 混合液（每種10mmol)10μL
正向引物（ 10μmol )20μL
反向引物( 10μmol )20μL
TaqDNA 聚合酶5μL ( 12.5U )
總反應體積500μL
a 用作PCR 的模板，使用0.05 ~100ng 克隆的質粒或噬菌體DNA , 0. 5~ 5μg 基因組DNA, 或者10~20μL 反轉錄反應生成的cDNA 。
7 輕微混合，渦璇離心1 ~ 2s 將試劑甩至試管底部，然后將其分裝到為0.5mL 薄壁PCR管中，每份100μL 。
8 將試管放入熱循環(huán)儀中，按下列程序進行25 個擴增循環(huán)：
i. 94 ℃ ?? 2min
ii. 94℃ ?? 45s
iii. 50℃ ? 45s
iv. 72℃ ? 60s
v 再次重復ii~iv, 24 個循環(huán)。
vi. 72 °C? 5min
vii. 4 °C?? 保存
viii. 結束
9 同時，用TAE 緩沖液制備一塊1 ％的瓊脂糖凝膠 。
10. PCR 反應結束后，將5μLPCR 產物與1μL 6X Ficoll Orange G 上樣緩沖液混合后上樣通過電泳分析PCR 產物。Orange G 染料位于電泳的前沿而不會在電泳時遮蓋任何條帶。
11. 將步驟10 剩余的DNA 擴增產物轉移至一個新的1.5mL 微量離心管中，加入1/10體積的乙酸鈉（3mo l/L, pH 5.2) 和2.5 倍體積的無水乙醇，渦旋混勻，在－20°C 或者更低的溫度下放置30min 以上，使PCR 產物沉淀。4°C 最大轉速離心30min, 棄去上清。
12. 用1mL 70％乙醇洗沉淀以去除殘留的鹽類。4 °C 最大轉速離心5min, 最大可能地棄去上清(70％乙醇），然后將離心管開蓋放置數分鐘使乙醇揮發(fā)。
13. 將DNA 沉淀溶解于50μL 水。
制備dsRNA
14. 將T7RNA 聚合酶置于冰上放置，其他試劑室溫放置。室溫下，按下列配方在1.5mL微量離心管中配制一個100μL 的體外轉錄體系：
無核酸酶水56.5μL
T7 轉錄緩沖液( 10 X)10μL
PCR 模板DNA5μL
ATP ( 100mmol/L）5μL
CTP (100mmol/L )5μL
UTP ( 100mmol/L）5μL
GTP （100mmol/L）8μL
OTT ( 1mol/L)0.5μL
T7RNA 聚合酶5μL (100U)
如果實驗需要更多的RNA, 等比例擴大反應體系。
15 輕輕渦旋1 ~ 2s 使試劑離心至試管底部。
16 37°C 孵育2h 。
17 加入5μL （ 10U) 無RNA 酶的胰腺DNA 酶I (RNase-free pancreatic DNase I) 。
18 輕輕渦旋1 ~ 2s 使試劑甩至試管底部。
19? 37°C 孵育30min 。
20 加入等體積的酚：氯仿( 1 : 1,VIV) ，渦旋20s 。4°C 最大轉速離心15min, 分離固相、液相，將液相層轉移至一個新的1.5mL 微量離心管中。
21 向液相中加入1/10 體積的乙酸鈉( 3mol/L ， pH 5.2) 和2.5 倍體積的無水乙醇，渦旋混勻，在－20°C 或者更低的溫度下放置30min 以上，使PCR 產物沉淀。4°C 最大轉速離心30min 。
22 棄去上清。加入1mL 70％乙醇洗滌沉淀，以去除殘留的鹽類。4 °C 最大轉速離心5min 使RNA 沉淀，最大限度地棄去上清(70％乙醇），然后將離心管開蓋放置數分鐘使乙醇揮發(fā)。
23 將RNA 沉淀溶解于100 μL 的無核酸酶水中。利用吸收光分光光度計測量RNA 的濃度。
24 使兩條鏈復性， 生成0.5μmol/L 的dsRNA 溶液：
正義RNA50pmol
反義RNA50pmol
復性緩沖液( 10 X)10 μL
無核酶水加至100 μL
25 將試管放在熱循環(huán)儀中， 95°C 1min, 關閉熱源使溫度緩慢降至室溫。
26 按照步驟21 、步驟22 的方法沉淀RNA 。
27 將沉淀溶于水中，制成lμg/μL 的儲備液，－8 0 °C 保存。
檢查dsRNA 的完整性
28 用0.5 X TBE 緩沖液配制一塊1％的瓊脂糖凝膠。
29 將dsRNA （步驟27 中得到的）和ssRNA （步驟23 中得到的有義鏈和反義鏈，作為對照使用）溶解于1 X 非變性凝膠上樣緩沖液中，終濃度為0.1 μg/μL 。
30 每個樣品上樣5μL, 在0.5 X TBE 緩沖液中進行電泳，恒壓75V 。
31 電泳結束后， 室溫下用SYBR Gold ( 1 : 10000 溶解于0.5 X TBE 緩沖液） 或者溴化乙錠( 1 : 20000 溶解于0.5 X TBE 緩沖液）染色10 min, 在紫外光下觀察RNA 條帶。
疑難解答
問題（步驟23) ： 沒有檢測到轉錄產物。
解決方案： 更換連接到引物上的T7 啟動子（步驟5 ) 。
檢查體外轉錄使用的試劑（步驟14 ) ； 確認所有的試劑都已添加，并且T7 聚合酶有活性。使用新鮮的NTP 和DTT 進行體外轉錄反應。
問題（步驟31) ： 發(fā)現(xiàn)污染條帶或與PCR 產物（步驟10 ) 同樣大小的條帶。
解決方案： 凝膠中有污染條帶表明由于RNA 酶的污染導致RNA 降解。要求實驗全程都要戴手套，并且要經常更換。使用無RNA 酶的試劑、試管和移液器吸頭。使用RNA 凝膠電泳專用的TBE 緩沖液和電泳裝置。與PCR 產物（步驟10 ) 同樣大小的條帶表明DNA酶Ⅰ 失活。對于仍然含有帶有模板DNA （步驟23 中） 的體外轉錄RNA （步驟16 ) 或純化后的RNA 要用不同批次DNA 酶Ⅰ（來自步驟17 ～ 步驟19 ) 處理，并重復純化和復性過程（步驟20 ～步驟27 ) ，然后再進行電泳檢測dsRNA （步驟28～步驟31 ) 。
配方
復性緩沖液(10 X)
試劑數量（ 以100 mL 計）終濃度( 10 X)
乙酸鉀( 2mol/L）50mL1mol/L
HEPES －氫氧化鉀( 1mol/L, pH 7.4 )30mL300mmol/L
乙酸鎂（1mol/L ）2mL20mmol/L
水補足100mL?
室溫保存。??
Ficoll-Orange G 上樣緩沖液(6 X)
試劑數量（以100mL 計）終濃度(6X)
Ficoll-40015g15% (m/V)
Orange G250mg0 25% (m/ V)
水補足100mL?
分裝為1mL, -20 ℃保存。??
非變性凝膠上樣緩沖液(10 X )
試劑數量（以100 mL 計）終濃度( 10 X)
Ficoll-40015g15% (m/V)
二甲苯藍250mg0 25% (m/V)
溴酚藍250mg0.25% (m/ V)
水補足100mL?
分裝為1mL , -20℃ 保存。??
PCR 緩沖液( 10 X)
試劑數量（以100mL 計）終濃度(10 X)
Tris-HCI ( 1 mol/L, pH 8.3)10mL100mmol/L
KCI ( 2mol/L )25mL500mmol/L
MgCl2 ( 1 mol/L )1.5mL15mmol/L
明膠(Gelatin) ( 2%,m/V)5mL0.1% (m/V)
水補足100mL
分裝為lmL , -20℃ 保存。
T7 轉錄緩沖液( 10 X)
試劑? 數量（以100mL 計）? 終濃度(10 X)
Tris-HCI ( 1 mol/L, pH 7 9)40mL400mmol/L
亞精胺(Spermiodine ) (1mol/L)2.5mL25mmol/L
MgCl2 (1mol/L)26mL260mmol/L
Triton X-1001mL0.1 % (m/V)
水補足100mL
分裝為1mL， －20℃ 保存。
