1. Author
McKimm-Breschkin博士目前是墨爾本大學(xué)彼得·多爾蒂研究所微生物學(xué)和免疫學(xué)系的榮譽(yù)研究員。1974年，在維多利亞州墨爾本莫納什大學(xué)獲得一級(jí)榮譽(yù)學(xué)位后，McKimm Breschkin博士作為富布賴(lài)特研究員在賓夕法尼亞州立大學(xué)好時(shí)醫(yī)學(xué)中心攻讀博士學(xué)位，研究麻疹病毒。
1979年，她作為伊麗莎白二世女王研究輪狀病毒的博士后研究員回到墨爾本大學(xué)微生物學(xué)系，隨后在沃爾特和伊麗莎·霍爾醫(yī)學(xué)研究所擔(dān)任博士后，與雅克·米勒一起從事細(xì)胞免疫學(xué)研究，然后在國(guó)家生物標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室（現(xiàn)TGA）擔(dān)任雞馬立克氏病研究。
1987-2016年，她在澳大利亞聯(lián)邦科學(xué)與工業(yè)研究組織（CSIRO）工作，是Relenza開(kāi)發(fā)團(tuán)隊(duì)的一員，Relenza是目前被稱(chēng)為神經(jīng)氨酸酶抑制劑（NIs）的第一類(lèi)藥物。她為X射線(xiàn)晶體學(xué)研究提供了純化的神經(jīng)氨酸酶蛋白，并作為藥物注冊(cè)的一部分進(jìn)行了臨床前耐藥性研究。自20世紀(jì)90年代初以來(lái)，她一直從事NI耐藥性研究，并與國(guó)內(nèi)和國(guó)際制藥公司合作開(kāi)發(fā)第一代和第二代流感抗病毒藥物。McKimm Breschkin博士是國(guó)際流感和其他呼吸道病毒疾病學(xué)會(huì)（isirvAVG）抗病毒小組委員會(huì)的成員，也是抗病毒研究的流感編輯。她對(duì)流感抗病毒藥物及其耐藥性機(jī)制保持著積極的興趣。
2. Background
副粘病毒科病毒包括引起幼兒、老年人和免疫功能低下者急性呼吸道感染的人類(lèi)副流感病毒 1-3 型 (hPIV1-3) 和禽新城疫病毒 (NDV)。 這些病毒具有兩種膜糖蛋白：血凝素神經(jīng)氨酸酶 (HN) 和融合蛋白 (F)。? HN具有多種功能，包括受體結(jié)合、唾液酸裂解、促進(jìn)病毒釋放和傳播，以及與 F 蛋白相互作用促進(jìn)膜融合。 神經(jīng)氨酸酶（NA）抑制劑，包括針對(duì)流感病毒 NA 的扎那米韋和 2-脫氧-2,3-脫氫-N-乙酰神經(jīng)氨酸（DANA），不僅可以抑制 HN 的催化功能，還可以干擾 與受體結(jié)合。 對(duì)硫代苷抑制劑與新城疫病毒 HN 的結(jié)構(gòu)研究確定了兩個(gè)不同的位點(diǎn)。功能上，一個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行受體結(jié)合和催化，第二個(gè)位點(diǎn)參與受體結(jié)合和融合促進(jìn)。
3. Methods
1. HN抑制實(shí)驗(yàn)
2. 蛋白的表達(dá)與純化
3. 結(jié)晶與X射線(xiàn)晶體衍射
4. Results
實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)進(jìn)行的酶抑制實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DFSA與HN的結(jié)合比較緩慢，可以使用DFSA來(lái)維持復(fù)合物的中間態(tài)進(jìn)而解析其晶體結(jié)構(gòu)。
令人驚訝的是，電子密度也表明 DFSA 結(jié)合了 hPIV3 二聚體的三個(gè)附加位點(diǎn)。 鏈 A 的位點(diǎn) 1 由殘基 R192、Q215、R502、N551 和 A528組成，位于酶活性位點(diǎn)附近的空腔中，其中兩個(gè)精氨酸R192 和R502 參與與共價(jià)中間體和糖基轉(zhuǎn)移類(lèi)似物的結(jié)合。鏈 A 的位點(diǎn) 2由殘基N262、T263、D264、Y266和一個(gè)水分子組成。當(dāng)hPIV3二聚體形成四聚體時(shí)，在晶體學(xué)2倍軸上具有松散的晶體接觸，所得四聚體中B鏈的兩個(gè)活性位點(diǎn)被封閉，但A鏈的另外兩個(gè)活性位點(diǎn)暴露于溶劑。 因此，鏈 A 的位點(diǎn) 1 在鏈 B 的相似位點(diǎn)處沒(méi)有顯示出顯著的電子密度。然而，鏈 B 單體僅對(duì)由殘基 K358 形成的第三個(gè) DFSA 結(jié)合位點(diǎn) 3 具有明確的密度。所有三個(gè)附加 DFSA 結(jié)合位點(diǎn)均不靠近 hPIV3 HN 中三個(gè)糖基化位點(diǎn)中的任何一個(gè)。
此外，D216 周?chē)鷼埢?210-221 的環(huán)（216 環(huán)）應(yīng)表現(xiàn)出更高的靈活性，并在脫輔基酶中采用更開(kāi)放的構(gòu)象，并在全酶中與抑制劑結(jié)合時(shí)關(guān)閉。有趣的是，對(duì)靠近酶活性的鏈 A 的位點(diǎn) 1 的識(shí)別表明該環(huán)涉及與 DFSA 相互作用。通過(guò) 216 環(huán)與二級(jí)位點(diǎn) DFSA 的相互作用僅在鏈 A 中觀察到。
5. Discussion
作者：Jennifer L. McKimm-Breschkin
通訊作者：Jennifer L. McKimm-Breschkin
單位：CSIRO Manufacturing, 343 Royal Parade, Parkville, Victoria 3052,Australia
年份：2015
期刊：Antiviral Research
科學(xué)問(wèn)題 ：HPIV3 HN蛋白結(jié)構(gòu)
結(jié)論：實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)首次鑒定了氧碳鎓離子過(guò)渡態(tài)類(lèi)似物。使用 DFSA 的 N2 NA和使用兩個(gè) DFSA 差向異構(gòu)體的 hNeu2對(duì)結(jié)構(gòu)和電子密度的分析表明，“共價(jià)”連接往往更長(zhǎng)。這種酶催化機(jī)制在與 DFSA 復(fù)合的流感 N9 NA 的晶體結(jié)構(gòu)中得到證實(shí)。重要的是，hPIV3 HN-DFSA 復(fù)合物結(jié)構(gòu)還揭示了新的二級(jí)受體結(jié)合位點(diǎn)。 配體處于經(jīng)典的受體結(jié)合椅構(gòu)象。位點(diǎn) 1 緊鄰活性位點(diǎn)和殘基 N551，突變分析表明 N551 和 H552是影響受體結(jié)合和融合觸發(fā)的次級(jí)結(jié)合位點(diǎn)。H552 不與 DFSA 直接接觸，但它涉及與跨二聚體界面的其他單體 H552 的堆積相互作用。 位點(diǎn) 1 還涉及 D216（216 環(huán)）周?chē)臍埢?，表明該柔性環(huán)對(duì)于 HN 受體結(jié)合和相反 HN 功能的平衡非常重要。 額外的位點(diǎn)在流感病毒和副粘病毒中并不保守且結(jié)構(gòu)相似。DFSA 結(jié)合在 N523 附近的證據(jù)，之前曾提出 N523 的聚糖會(huì)掩蓋第二個(gè)位點(diǎn)。 由于 hPIV3 HN 似乎以低效率執(zhí)行受體結(jié)合和催化功能，額外的受體結(jié)合位點(diǎn)可能會(huì)增加病毒結(jié)合的整體親合力，以促進(jìn)病毒進(jìn)入。
此外，研究表明減慢酶促反應(yīng)會(huì)致 hPIV3 HN 和流感 N9 NA 中類(lèi)似的中間體被捕獲。在距離位點(diǎn) 3 的預(yù)期位置不遠(yuǎn)的鏈 A 中也存在殘余密度。事實(shí)上，確切的位點(diǎn) 3 被對(duì)稱(chēng)相關(guān)分子遮擋。 這表明酶的結(jié)晶形式可能對(duì)二級(jí)受體結(jié)合位點(diǎn)的群體產(chǎn)生不同的影響。
hPIV3 療法的開(kāi)發(fā)需要針對(duì) HN 的催化和受體結(jié)合位點(diǎn)，因此了解所有可能的配體相互作用非常重要。 基于 DFSA 的抑制劑的優(yōu)點(diǎn)在于，由于其結(jié)構(gòu)與天然底物的結(jié)構(gòu)相似，并且其結(jié)合需要酶活性，這意味著產(chǎn)生耐藥性的可能性要小得多。
