問題
Paired-End測(cè)序與Mate-Pair測(cè)序相對(duì)于單端測(cè)序有何優(yōu)勢(shì)？
Paired-End中的Read1和Read2到底是啥關(guān)系？它們是如何參與拼接和比對(duì)的呢？
Mate-Paired與Paird-End兩種不同建庫測(cè)序的區(qū)別在哪里？產(chǎn)生的數(shù)據(jù)有何不同？各自有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？
Single-Read測(cè)序、Paired-End測(cè)序、Mate-Pair測(cè)序，何時(shí)選擇哪種測(cè)序策略？讀長、插入序列為多少？
不懂的問題很多，困惑很多，借此尋找答案的機(jī)會(huì)也將單端測(cè)序與雙末端測(cè)序的區(qū)別整理一下，鞏固基礎(chǔ)知識(shí)。
學(xué)基礎(chǔ)
Single-Read測(cè)序、Paired-end和Mate-pair主要區(qū)別
以上三者的區(qū)別主要在于測(cè)序文庫的構(gòu)建方法上。
Single-Read測(cè)序(Single-read)首先將DNA樣本進(jìn)行片段化處理形成200-500bp的片段，引物序列連接到DNA片段的一端，然后末端加上接頭，將片段固定在
flow cell上生成DNA簇，上機(jī)測(cè)序單端讀取序列。該方式建庫簡單，操作步驟少，常用于小基因組、轉(zhuǎn)錄組、宏基因組測(cè)序。
Paired-end文庫制備是指在構(gòu)建待測(cè)DNA文庫時(shí)在兩端的接頭上都加上測(cè)序引物結(jié)合位點(diǎn)，在第一輪測(cè)序完成后，去除第一輪測(cè)序的模板鏈，用對(duì)讀測(cè)序模塊(Paired-End Module)引導(dǎo)互補(bǔ)鏈在原位置再生和擴(kuò)增，以達(dá)到第二輪測(cè)序所用的模板量，進(jìn)行第二輪互補(bǔ)鏈的合成測(cè)序。
Mate-pair文庫制備旨在生成一些短的DNA片段，這些片段包含基因組中較大跨度(2-10 kb)片段兩端的序列，更具體地說：首先將基因組DNA隨機(jī)打斷到特定大?。?-10 kb范圍可選）；然后經(jīng)末端修復(fù)，生物素標(biāo)記和環(huán)化等實(shí)驗(yàn)步驟后，再把環(huán)化后的DNA分子打斷成400-600 bp的片段并通過帶有鏈親和霉素的磁珠把那些帶有生物素標(biāo)記的片段捕獲。這些捕獲的片段再經(jīng)末端修飾和加上特定接頭后建成mate-pair文庫，然后上機(jī)測(cè)序。
解困惑&答問題
為何要有 Paired-end這樣的技術(shù)發(fā)明呢？
主要原因在于Illumina的二代測(cè)序儀的讀長短，相對(duì)于第一代sanger測(cè)序法（約1000bp）或者跟同屬于NGS的其他測(cè)序儀相比短了許多。因此illumina發(fā)展了 Paired-end的建庫測(cè)序技術(shù)。同時(shí)這種技術(shù)還大大推進(jìn)了基因組學(xué)數(shù)據(jù)分析的發(fā)展。
例如，依賴于Paired-end的技術(shù)，假設(shè)一個(gè)DNA片段剛好跨越了重復(fù)序列區(qū)域（下圖左側(cè)）以及獨(dú)特序列區(qū)域（下圖右側(cè)）。加入只讀取Single-Read，我們只會(huì)獲得紅色實(shí)線的序列信息，也就是ATATATAT。接下來，當(dāng)我們想要將這段read跟reference genome做比對(duì)的時(shí)候，便會(huì)出現(xiàn)問題：到底這段read是出自于紅色實(shí)線的位置，還是紅色虛線的位置？這個(gè)問題我們就可以使用Paired-end的技術(shù)來加以解決。由于Paired-end reads之間的距離為已知（在此我們?cè)O(shè)為34bp），我們便可以先定位綠色read的位置，在正確定位出左邊紅色re reads之間 ad的位置，而不至于將其誤判在紅色虛線的位置。如下圖所示：
此外，根據(jù)我們內(nèi)部的一個(gè)測(cè)試。在進(jìn)行de novo assembly的時(shí)候，序列長度以及Paired-end的序列信息可以讓我們得到最好的組裝結(jié)果。透過下邊可以發(fā)現(xiàn)，Paired-end的序列信息甚至比序列長度要來得更為重要。因此，建議大家在選擇測(cè)序方案的時(shí)候，盡量選擇Paired-end吧！
總結(jié)，不管采用哪種方式，PE/MP測(cè)序的結(jié)果除了序列本身外還有中間的距離信息。距離信息可以用來判定組裝后成對(duì)reads間的序列是否準(zhǔn)確，也可用來幫助組裝。這種測(cè)序方式可以用來解決基因組中的重復(fù)序列難題，被廣泛采用。目前在采用雙端測(cè)序法時(shí)，454平臺(tái)建庫最長（最長能達(dá)到20k），Illumina 建庫長度最短（小于5k）。由于Solid和Solexa都是采用橋式擴(kuò)增的方式，其本身自帶Paired-End測(cè)序能力。而454和Ion Torrent要對(duì)打斷后的片段進(jìn)行環(huán)化、酶切，然后才能進(jìn)行 mate-paired 測(cè)序。因此建庫的成本會(huì)比單端測(cè)序的高 。
Paired-End reads是如何比對(duì)的？
Paired-End reads是如何拼接的？
