環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類特殊的非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），也是RNA領(lǐng)域最新的研究熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)的線性RNA（linear RNA，含5’和3’末端）不同，circRNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定，不易降解。

目前研究表明，在生物體內(nèi)，circRNA主要通過其序列特征，發(fā)揮miRNA海綿、RNA-binding proteins （RBPs）海綿以及翻譯短肽等生物學(xué)功能（1-2）。因此，確定其的全長(zhǎng)序列，是進(jìn)行circRNA功能研究的重要基礎(chǔ)。由于目前對(duì)于circRNA的研究多采用二代測(cè)序的方法，而circRNA的內(nèi)部序列與線性mRNA分子高度相似，單純通過算法（識(shí)別反向剪切位點(diǎn)）很難區(qū)分來自環(huán)形RNA和線性RNA分子的讀段，以及確定全長(zhǎng)circRNA內(nèi)部組成。近期的研究中利用了長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)，對(duì)circRNA的全長(zhǎng)重構(gòu)進(jìn)行了嘗試（3-4）。因此，目前研究方法對(duì)于circRNA結(jié)構(gòu)的識(shí)別能力主要被二代測(cè)序的讀長(zhǎng)所限制，對(duì)于長(zhǎng)度較長(zhǎng)（>500bp）的circRNA分子，仍然缺少有效的全長(zhǎng)重構(gòu)手段。

趙方慶教授團(tuán)隊(duì)前期提出了CIRI-AS算法（基于BSJ讀段對(duì)比結(jié)果對(duì)環(huán)形RNA內(nèi)部可變剪接結(jié)構(gòu)進(jìn)行識(shí)別）。后續(xù)研究開發(fā)了CIRI-full算法（通過識(shí)別雙端250bp測(cè)序數(shù)據(jù)中反向重疊區(qū)特征，對(duì)500bp以內(nèi)的環(huán)形RNA進(jìn)行全長(zhǎng)重構(gòu)）。上述方法主要基于短讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)，難以對(duì)長(zhǎng)度500bp以上的circRNA的全長(zhǎng)序列進(jìn)行有效識(shí)別。

在此基礎(chǔ)上，2021年3月11日，中國(guó)科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院趙方慶教授團(tuán)隊(duì)在Nature Biotechnology雜志上發(fā)表了題為Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long 的文章，開發(fā)了一種基于三代納米孔測(cè)序平臺(tái)（Oxford Nanopore Technologies ，ONT）高效測(cè)定circRNA全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法：利用隨機(jī)引物對(duì)circRNA進(jìn)行的滾環(huán)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后，使用三代納米孔測(cè)序技術(shù)（ONT）對(duì)circRNA的全長(zhǎng)序列進(jìn)行直接測(cè)序，并開發(fā)了CIRI-long 算法，實(shí)現(xiàn)對(duì)長(zhǎng)測(cè)序讀段中的circRNA序列進(jìn)行識(shí)別和全長(zhǎng)重構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的circRNA二代測(cè)序技術(shù)相比，該方法將circRNA檢測(cè)靈敏度提升了20倍，并可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同長(zhǎng)度（<100bp - 5kb）的circRNA全長(zhǎng)序列的無偏識(shí)別，大幅提升了環(huán)形轉(zhuǎn)錄本的重構(gòu)能力，為其功能研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)方法和計(jì)算工具。

趙方慶教授實(shí)驗(yàn)室主頁(yè)（圖1）：https://bioinfo.biols.ac.cn/

圖1.趙方慶教授實(shí)驗(yàn)室主頁(yè)

一、CIRI-long軟件介紹

因?yàn)閏ircRNAs及其對(duì)應(yīng)的線性信使RNA之間的相似性，利用短讀長(zhǎng)RNA測(cè)序重建circRNA的全長(zhǎng)序列一直是具有挑戰(zhàn)性的，先前的測(cè)序方法無法實(shí)現(xiàn)對(duì)全長(zhǎng)circRNA的高通量檢測(cè)。趙方慶教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種利用三代納米孔（ONT）測(cè)序技術(shù)進(jìn)行circRNA及其相應(yīng)的異構(gòu)體（isoform）富集和全長(zhǎng)測(cè)序的方案。環(huán)狀逆轉(zhuǎn)錄和片段大小選擇能比先前方法從總RNA中多富集出20倍的circRNAs。我們開發(fā)了一個(gè)使用長(zhǎng)度長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)（CIRI-long）circRNA鑒定軟件，用于重建circRNAs的序列。該算法工作流程利用模擬數(shù)據(jù)，通過與 Illumina 測(cè)序以及定量實(shí)時(shí)RT-PCR 的比較進(jìn)行了驗(yàn)證。作者使用CIRI-long來分析成年小鼠腦組織樣本，并系統(tǒng)地對(duì)circRNAs進(jìn)行注釋分析，包括來自線粒體circRNAs。作者鑒定了一種新的內(nèi)含子自連接circRNA的特殊的剪接和表達(dá)模式。此方法利用了三代納米孔測(cè)序的長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)全長(zhǎng)circRNA序列的無偏重建（圖2）。

圖2. CIRI-long文章

二、CIRI-long的安裝

依賴軟件：

• gcc 4.8+ 或 clang 3.4+
• cmake 3.2+
• python>=3.7
• samtools=1.9 或更高
• minimap2

1. 從源代碼安裝

$ git clone https://github.com/bioinfo-biols/CIRI-long.git CIRI-long
$ cd CIRI-long

# Create virtual environment
$ python3 -m venv venv

# Activate virtualenv
$ source ./venv/bin/activate

# Install CIRI-long
$ make

# Test for installation
$ make test

2. 使用pip安裝

個(gè)人推薦使用，方便快捷。

$ pip install CIRI-long

三、CIRI-long的使用方法

軟件主頁(yè)：https://github.com/bioinfo-biols/CIRI-long

1. 基本用法

CIRI-long兩個(gè)命令: CIRI-long call 和 CIRI-long collapse，因此整個(gè)流程分為兩步。

usage: CIRI-long [-h] [-v] {call,collapse} ...

positional arguments:
  {call,collapse}  commands

optional arguments:
  -h, --help       show this help message and exit
  -v, --version    show program's version number and exit

2. 步驟1：circRNA 鑒定

• 基本用法

#主命令
$ CIRI-long call [-h] [-i READS] [-o DIR] [-r REF] [-p PREFIX] [-a GTF] [--canonical] [-t INT] [--debug]

optional arguments:
  -h, --help            show this help message and exit  #幫助文檔
  -i READS, --in READS  Input reads.fq.gz  #輸入文件
  -o DIR, --out DIR     Output directory, default: ./  #輸出文件夾路徑
  -r REF, --ref REF     Reference genome FASTA file  #參考基因組ref.fa文件，需要用bwa進(jìn)行索引
  -p PREFIX, --prefix PREFIX
                        Output sample prefix, (default: CIRI-long)  #輸出文件前綴
  -a GTF, --anno GTF    Genome reference gtf, (optional) #基因組注釋文件（可選）
  -c CIRC, --circ CIRC  Additional circRNA annotation in bed/gtf format, 
                        (optional)  #以bed/gtf格式輸出circRNA注釋文件（可選）
  -t INT, --threads INT Number of threads, (default: use all cores)  #線程數(shù)
  --debug               Run in debugging mode, (default: False)  #糾錯(cuò)模式運(yùn)行

注意：
參考基因組需要bwa的索引。在運(yùn)行CIRI-long之前，使用bwa index命令對(duì)參考基因組ref.fa文件進(jìn)行索引。

• 使用示例

#下載演示數(shù)據(jù)
$ wget https://github.com/bioinfo-biols/CIRI-long/releases/download/v0.6-alpha/CIRI-long_test_data.tar.gz

#演示數(shù)據(jù)解壓
$ tar zxvf CIRI-long_test_data.tar.gz
$ cd test_data

#使用```bwa index```命令對(duì)參考基因組文件進(jìn)行索引
$ bwa index -a bwtsw mm10_chr12.fa mm10_chr12.fa

#運(yùn)行CIRI-long鑒定circRNA
$ CIRI-long call -i test_reads.fa \  #輸入文件
               -o ./test_call \ #輸出路徑
               -r mm10_chr12.fa \ #參考基因組
               -p test \ #輸出文件前綴
               -a mm10_chr12.gtf \ #基因組注釋文件
               -t 8 #使用線程數(shù)

• 輸出文件

test_call
├── test.cand_circ.fa  # 主要文件，circRNA序列文件。
├── test.json
├── test.log
├── test.low_confidence.fa  # circRNA序列文件，低置信度。
└── tmp
    ├── ss.idx
    ├── test.ccs.fa
    └── test.raw.fa

# 如果不加 -c 選項(xiàng)，則產(chǎn)生一個(gè)文件夾，7個(gè)文件

• 使用非經(jīng)典剪切信號(hào)
  如果想使用其它剪切信號(hào)，可以在腳本align.py修改SPLICE_SIGNAL，格式為：{(5’SS, 3’SS): Priority} 。

默認(rèn)：

SPLICE_SIGNAL = {
    ('GT', 'AG'): 0,  # U2-type
    ('GC', 'AG'): 1,  # U2-type
    ('AT', 'AC'): 2,  # U12-type
    ('GT', 'AC'): 2,  # U12-type
    ('AT', 'AG'): 2,  # U12-type
}

3. 步驟2：isoform合并（collapose）

• 基本用法

可以將多個(gè)樣本的circRNA結(jié)果合并。

#主命令
$ CIRI-long collapse [-h] [-i LIST] [-o DIR] [-p PREFIX] [-r REF] [-a GTF] [--canonical] [-t INT] [--debug]

optional arguments:
  -h, --help            show this help message and exit  #幫助文檔
  -i LIST, --in LIST    Input list of CIRI-long results  #樣本名稱和路徑的list文件
  -o DIR, --out DIR     Output directory, default: ./  #輸出文件夾路徑
  -p PREFIX, --prefix PREFIX
                        Output sample prefix, (default: CIRI-long)  #輸出文件前綴
  -r REF, --ref REF     Reference genome FASTA file   #參考基因組文件
  -a GTF, --anno GTF    Genome reference gtf, (optional)  #參考基因組注釋文件
  -c CIRC, --circ CIRC  Additional circRNA annotation in bed/gtf format,
                        (optional) #以bed/gtf格式輸出circRNA注釋文件（可選）
  -t INT, --threads INT
                        Number of threads, (default: use all cores)   #線程數(shù)
  --debug               Run in debugging mode, (default: False)  #糾錯(cuò)模式運(yùn)行

需要先創(chuàng)建一個(gè)想要合并樣本（*.cand_circ.fa）的名稱和路徑的list文本文件，以空格分隔。

#list 文件內(nèi)容
sample1_name /path/to/sample1/cand_circ.fa
sample2_name /path/to/sample2/cand_circ.fa

• 使用示例

創(chuàng)建一個(gè)名為test.list文本文件：

test ./test_call/test.cand_circ.fa

運(yùn)行CIRI-long collapse合并一個(gè)或多個(gè)樣本結(jié)果。

 $ CIRI-long collapse -i ./test.lst \  #輸入文件
                    -o ./test_collpase \  #輸出文件夾路徑
                    -p test \  #文件前綴
                    -r ./mm10_chr12.fa \   #參考基因組
                    -a ./mm10_chr12.gtf \  #參考基因組注釋文件
                    -t 8   #線程

• 輸出文件

test_collpase
├── test_collpase.expression
├── test_collpase.isoforms
├── test_collpase.info
├── test_collpase.log
├── test_collpase.reads
└── tmp
    ├── ss.idx
    └── test_collpase.corrected.pkl

# 如果不加 -c 選項(xiàng)，則產(chǎn)生一個(gè)文件夾，6個(gè)文件

• 輸出文件格式

1）主要輸出文件，GTF格式文件（test_collpase.info），包含所有circRNA的詳細(xì)信息和circRNA反向剪切區(qū)域的注釋列。

屬性列包含了幾個(gè)預(yù)先定義的關(guān)鍵詞及其賦值：

2）表達(dá)矩陣

test_collpase.expression: 包含所有樣本中circRNA的表達(dá)水平，tsv文件格式。

test_collpase.isoforms:包含所有樣本中每個(gè)circRNA異構(gòu)體（isoform）使用指數(shù)（index），tsv文件格式。

isoform使用指數(shù)公式：

Isoform usage index = Isoform_reads（某個(gè)異構(gòu)體-isoform的數(shù)量） / Sum of all isoforms from the same BSJ (共享同一個(gè)反向剪切位點(diǎn)的所有異構(gòu)體-isoform總和)

4. 步驟3：輸出文件可視化

從版本v1.1.0以后，CIRI-long包含misc/conver_bed.py 腳本，用戶可以使用此腳本將 circRNA.info（gtf格式）轉(zhuǎn)化為.bed格式，此.bed文件可以利用IGV或Jbrowse2軟件進(jìn)行可視化。具體轉(zhuǎn)化代碼如下：

$ python3 misc/convert_bed.py collapse_out/sample.info sample_circ.bed

四、參考文獻(xiàn)

1. 專家點(diǎn)評(píng) | 基于納米孔測(cè)序的環(huán)形RNA識(shí)別和重建新技術(shù)
2. Chen L-L. The Expanding Regulatory Mechanisms and Cellular Functions of Circular RNAs. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 2020.
3. Zheng Y, Ji P, Chen S, et al. Reconstruction of Full-Length Circular RNAs Enables Isoform-Level Quantification. Genome Medicine, 2019, 11(1): 4. Xin R, Gao Y, Gao Y, et al. IsoCirc Catalogs Full-Length Circular RNA Isoforms in Human Transcriptomes. Nature Communications, 2021, 12(1): 266.
4. Zhang, J., Hou, L., Zuo, Z., Ji, P., Zhang, X., Xue, Y., & Zhao, F. Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long. Nature Biotechnology. (2021).
5. CIRI-long 使用文檔： https://ciri-cookbook.readthedocs.io/en/latest