空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)追蹤-第三期
??????? 在本期內(nèi)容中，我們先借助Spatial Transcriptomics公司的原產(chǎn)品的Protocol詳細(xì)了解一下技術(shù)的細(xì)節(jié)和要求。
??????? 空間轉(zhuǎn)錄組的大致流程為，首先，先對凍存組織進(jìn)行OCT包埋，冷凍切片，取部分切片提取RNA進(jìn)行質(zhì)檢，RIN值>7才能夠達(dá)到后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。樣本RIN值合格后，即可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)；正式實(shí)驗(yàn)中，包括組織優(yōu)化Tissue Optimization（利用組織優(yōu)化芯片）和正式的文庫準(zhǔn)備Library Preparation（LP芯片）先將切片粘附在組織優(yōu)化芯片上，進(jìn)行固定和H&E染色和顯微鏡的明場拍照，然后進(jìn)行組織優(yōu)化的后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟。組織優(yōu)化流程是為了測試感興趣的組織是否與空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)相兼容，并在整個(gè)空間轉(zhuǎn)錄組方案中優(yōu)化給定組織的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。
??????? 組織優(yōu)化芯片結(jié)構(gòu)如下：
??????? 組織優(yōu)化芯片有6個(gè)亞區(qū)，8x8mm，每個(gè)反應(yīng)區(qū)域?yàn)?.5x7.5mm，推薦用其中5個(gè)測試組織優(yōu)化條件，1個(gè)用于陰性對照。陰性對照放置同樣的組織切片，用其他試劑代替透化試劑處理；但是在預(yù)透化步驟仍然會(huì)產(chǎn)生弱信號(hào)，不過優(yōu)化好的會(huì)產(chǎn)生比隱性對照強(qiáng)很多的信號(hào)。
??????? 組織優(yōu)化的流程：
??????? 組織優(yōu)化用的載玻片上有6個(gè)覆蓋有RNA捕獲探針的的正方形亞區(qū)。單個(gè)組織切片放置于每個(gè)亞區(qū)內(nèi)，然后對組織進(jìn)行甲醛固定、H&E染色、成像。然后加入透化試劑，使RNA從組織切片中釋放出來，并與緊鄰的RNA捕獲探針雜交。設(shè)置一系列不同的透化條件能使用戶確定感興趣組織的最佳方案。隨后利用熒光標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行cDNA合成。最后，為了準(zhǔn)確檢測cDNA產(chǎn)生的熒光，組織必須被去除，組織去除步驟是優(yōu)化的另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。
組織處理和切片注意事項(xiàng)：
?新鮮組織凍存于-80度，避免融化。
?如果凍存組織沒有用OCT包埋，那么在切片之前需要進(jìn)行OCT包埋。包埋之前需要將OCT預(yù)冷，使其變硬后包埋。
?組織切片大小最大為7.5mm x 7.5mm，與組織優(yōu)化芯片相匹配，但是如果計(jì)劃用相同的組織去做正式的實(shí)驗(yàn)，那么組織切片不能超過6.3mm x 6.7mm。
?組織+OCT需要10mm x 10mm見方（OCT會(huì)在固定和染色過程中被溶解和沖洗掉）。
?組織用冷凍切片機(jī)切片。
?先把TO芯片在冷凍切片機(jī)中預(yù)冷。
?推薦組織切片厚度為5-16μm；
?將組織切片放置在TO芯片上，確保放在玻片有效的表面上；（仔細(xì)放置組織切片，避免觸碰到組織本身，可以觸碰周圍的OCT。將1個(gè)手指放在TO玻片的背面幾秒鐘，使玻片變暖，一旦目標(biāo)區(qū)域玻片被溫?zé)岷?，組織會(huì)自動(dòng)粘附到玻片上）；
?當(dāng)組織切片放置在TO玻片上后，可-80度至多保存7天，或者可以直接開展實(shí)驗(yàn)。
明場成像注意事項(xiàng)：
?明場成像系統(tǒng)是為了捕獲H&E染色的圖像。
?為了在合理的時(shí)間范圍內(nèi)生成染色組織切片的高分辨率圖像，我們建議低放大率，高數(shù)值孔徑（NA）(e.g. 10x NA 0.45, 20x NA 0.5, 20x
?NA 0.75)，捕獲的圖像需要利用計(jì)算軟件進(jìn)行整合。
熒光掃描注意事項(xiàng):
?采用微陣列掃描儀（如Innosca 710）能利用532nm激光有效激發(fā)熒光，建議分辨率為10μm/pixel。
?利用標(biāo)準(zhǔn)的熒光顯微鏡也能夠捕獲信號(hào)，但是需要broad Cy3/TRITC filter。(e.g. Chroma 49004; Zeiss 43HE)，高NA物鏡(e.g. 20x NA 0.75)，以及更長的曝光時(shí)間。得到的熒光足跡就如H&E染色看到的形態(tài)，并且與背景是很容易好區(qū)分的。
組織移除注意事項(xiàng)：
?對于纖維少的、脂肪類的組織像腦，采用酶移除法 Proteinase K；
?對于纖維多組織，先采用化學(xué)試劑移除法β-mercaptoethanol ，再用酶移除法Proteinase K ；
*這里需要用TO實(shí)驗(yàn)中摸索出的處理?xiàng)l件。
*如果組織移除失敗，組織還留在玻片上，那就要再做一個(gè)組織優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，增加或者更長時(shí)間的組織移除步驟。如果只有部分組織殘留，你還可以試著去掃描玻片，然而，重要的是你要能區(qū)分很強(qiáng)的組織自身的發(fā)出的熒光型號(hào)和相對弱的cDNA足跡信號(hào)。
?該圖是測試小鼠腦10μm切片組織優(yōu)化透化條件的圖?？梢钥吹脚c陰性對照相比，透化會(huì)顯著增強(qiáng)信號(hào)。該組織6分鐘的透化處理能產(chǎn)生最強(qiáng)的cDNA熒光足跡。因此6分鐘作為透化的最佳時(shí)間。
以上就是組織優(yōu)化TO的主要內(nèi)容，下面我們來介紹正式文庫LP準(zhǔn)備的方法。
?LP的玻片有6個(gè)亞區(qū)。每個(gè)亞區(qū)表面含有標(biāo)簽序列陣列點(diǎn)能夠捕獲mRNA，同時(shí)也作為反轉(zhuǎn)錄的引物。每個(gè)點(diǎn)中含有上百萬個(gè)標(biāo)簽序列，并且每個(gè)點(diǎn)有獨(dú)特的barcode，能夠區(qū)分每個(gè)點(diǎn)。每個(gè)陣列含有1007個(gè)這樣的點(diǎn)。
?組織切片放置在每個(gè)陣列上，固定，蘇木精&伊紅染色和拍照。接著，在細(xì)胞上加入透化試劑使mRNA從組織切片中釋放出來，與玻片表面的標(biāo)簽雜交。然后進(jìn)行cDNA合成。cDNA合成后，需要將組織從玻片表面移除（這是一個(gè)需要通過TO實(shí)驗(yàn)選擇最優(yōu)條件的關(guān)鍵步驟）。
?組織移除之后，表面標(biāo)簽/cDNA和結(jié)合的mRNA被從玻片表面切掉。每個(gè)陣列上的標(biāo)簽被搜集到不同的tube中。最后，切下來的標(biāo)簽用于準(zhǔn)備測序文庫。
??????? 推薦做5個(gè)組織切片，第6個(gè)亞區(qū)用作陽性對照。陽性對照是為了確保cDNA合成的是成功的。陽性對照不要放置組織切片，只需要用control RNA和cDNA master mix。RNA需要片段化成大約300bp。如果不想用陽性對照，也可以全部放置組織切片。
明場掃描：
熒光掃描：
??????? 熒光掃描的目的是為了準(zhǔn)確比對H&E染色圖像與空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的每個(gè)陣列中的點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)最后每個(gè)熒光點(diǎn)圖像必須獲得。這些熒光點(diǎn)會(huì)與明場圖片中蘇木精染色的點(diǎn)進(jìn)行比對。
最后我們來看一下總體實(shí)驗(yàn)流程：
??????? 以上就是本期的全部內(nèi)容了，spatial transcriptomics被10x Genomcis公司收購后，對整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程和芯片都進(jìn)行了非常大的優(yōu)化，據(jù)說可以在1天內(nèi)完成從獲得切片開始到文庫構(gòu)建的全部流程，大大降低了實(shí)驗(yàn)過程的復(fù)雜度。下期將帶大家了解優(yōu)化后的芯片和實(shí)驗(yàn)流程~
「2019年10月29日 ·北京」
