反向PCR
普通PCR、原位PCR、反向PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR的 基本原理和操作步驟（三）
反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規(guī)PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實驗時選擇已知序列內(nèi)部沒有切點的限制性內(nèi)切酶對該段DNA進行酶切，然后用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環(huán)化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產(chǎn)物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究.
反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補，但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。
PCR只能擴增兩端序列已知的基因片段，反向PCR可擴增中間一段已知序列，而兩端序列未知的基因片段不擴增。
反向PCR的目的在于擴增一段已知序列旁側(cè)的DNA，也就是說這一反應體系不是在一對引物之間而是在引物外側(cè)合成DNA。反向PCR可用于研究與已知DNA區(qū)段相連接的未知染色體序列，因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引物雖然與核心DNA區(qū)兩末端序列互補，但兩引物3’端是相互反向的。擴增前先用限制性內(nèi)切酶酶切樣品DNA，然后用DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA分子，通過反向PCR擴增引物的上游片段和下游片段；現(xiàn)已制備了酵母人工染色體（YAC）大的線狀DNA片段的雜交探針，這對于轉(zhuǎn)座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。
該方法的不足是：①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。
利用反向PCR可對未知序列擴增后進行分析，探索鄰接已知DNA片段的序列，并可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆，建立全長的DNA探針。適用于基因游走、轉(zhuǎn)位因子和已知序列DNA旁側(cè)病毒整合位點分析等研究。
用傳統(tǒng)的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實際上限為3-4kb。在許多情況下，首先 需要進行Southern雜交來確定內(nèi)切酶用以產(chǎn)生大小適于環(huán)化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區(qū)的內(nèi)切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板(依賴于引物)的上游 或上游區(qū)，而不裂解核心區(qū)的酶則使兩上邊側(cè)序列都擴增，并帶有由內(nèi)切酶和環(huán)化類 型決定的接點(例如，互補突頭連接與鈍頭連接)。對于擴增左翼或右翼序列，初試時 最好靠近識別上個堿基位位的酶，并已知在核心區(qū)有其方便的裂解位點。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點。
用T4連接酶在稀DNA濃度下環(huán)化更容易形成單環(huán)。在一些實驗中，為產(chǎn)生對反向 PCR大小適當?shù)腄NA片段需要兩種內(nèi)切酶，但這樣所產(chǎn)生的片段末端則不適于連接，環(huán) 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前，需用酚或熱變性使內(nèi)切 酶失活。
聚合酶鏈反應條件與經(jīng)典所用的相同，例如，94℃-30秒變性，58℃-30秒引物退火， Taq聚合酶70℃延伸3分鐘，進行30個循環(huán)?？筛淖働CR條件以生產(chǎn)特異產(chǎn)物。將反向 PCR用于測序時，與核心區(qū)末端后部結合的擴增引物更為有用，它使測序引物擴增部 分的核心序列與未知邊側(cè)序列間的接點更近，減少了擴增引物的干擾。
描述一種大聚合酶鏈反應應用的方法，使在已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知成幾何級數(shù)擴增。用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)的，以產(chǎn)生適合于擴 增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子的引物同源于環(huán)上核心區(qū) 的末端序列，但其方向性，使鏈的延長經(jīng)過環(huán)上的未知區(qū)而不是分開引物的核心區(qū)。這種反向方法可用于擴增本來就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應用于制備未知序列 探針或測定邊側(cè)區(qū)域本身的上、下游序列。
