這一部分我們就以人p53CDS區(qū)為目的基因片段和pUC19為載體為例，講解一下無(wú)縫克隆的具體操作流程。
一. 查找p53目的基因
? ? 1. 在NCBI中搜索欄換為Gene，并輸入所要搜索的目的基因如p53。
選擇Gene，輸入p53
2. 在如圖所示的搜索結(jié)果中，選擇自己所需的基因，我們選擇物種Homo sapiens(human)的TP53，點(diǎn)擊并進(jìn)入詳細(xì)信息。
選擇所需的物種
? ? 3. 點(diǎn)擊NCBI Reference Sequences (RefSeq)或者往下翻，一直到mRNA and protein
查找NCBI Reference Sequences (RefSeq)
找到mRNA and protein，點(diǎn)擊紅色圈出的位置
? ? 4. 往下翻閱，找到TP53基因的詳細(xì)信息，找到蛋白編碼區(qū)CDS
找到CDS區(qū)域
5.進(jìn)去CDS的序列，選擇FASTA格式，進(jìn)行復(fù)制。
找到CDS序列
二. 引物設(shè)計(jì)
? ? 1. In-Fusion/Takara 無(wú)縫克隆引物設(shè)計(jì)
? ? 這個(gè)為Takara試劑盒對(duì)應(yīng)的引物設(shè)計(jì)網(wǎng)址：https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/primer-design-and-other-tools
? ? 1.1 在addgene中找到pUC19質(zhì)粒序列，并復(fù)制。
? ? 2.2 打開(kāi)引物設(shè)計(jì)界面
按照?qǐng)D中標(biāo)注的，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求區(qū)選擇合適的方法，填入序列；選擇克隆還是突變；線性化選擇；酶切位點(diǎn)選擇；目的基因片段輸入；填好之后點(diǎn)擊Design Primers。
引物設(shè)計(jì)界面
? ? 下圖為引物設(shè)計(jì)的結(jié)果，包括特異性引物序列，同源序列引物設(shè)計(jì)，Tm溫度，F(xiàn)orward and Reverse Primers，也可以點(diǎn)擊下載結(jié)果，結(jié)果中會(huì)包含全部序列和引物。
引物設(shè)計(jì)結(jié)果
后續(xù)無(wú)縫克隆過(guò)程
? ? 2. 天根EasyGeno對(duì)于引物設(shè)計(jì) 為此網(wǎng)址：http://123.56.75.195/?
? ? 如圖所示，選擇線性化方式，選擇插入片段個(gè)數(shù)，選擇酶切位點(diǎn)以及選擇是否保留酶切位點(diǎn)。
EasyGeno設(shè)計(jì)引物
引物設(shè)計(jì)結(jié)果
? ? 像賽默飛的https://www.thermofisher.com/order/oligoDesigner/?GeneArt 無(wú)縫克隆線上工具；NEB的http://nebuilder.neb.com/都可以用來(lái)設(shè)計(jì)引物。
? ? 之后定制引物，擴(kuò)增，連接，按照各個(gè)廠商的試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟來(lái)，就能完成一次完美的無(wú)縫克隆。
? ? 關(guān)于無(wú)縫克隆這一部分，從基礎(chǔ)原理到應(yīng)用，具體操作流程大致介紹完了，最后小部分關(guān)于亞克隆和文庫(kù)的構(gòu)建沒(méi)有多講，其實(shí)就是利用上述所講內(nèi)容的具體應(yīng)用。希望大家都能一次就順利構(gòu)建出自己所需的載體??！
