周三了，又是新的一周的最黃金的時間，不知道為什么，29歲的自己如此的焦慮，可能自己是個loser吧，又到了我們單細胞空間聯(lián)合分析的內(nèi)容了，今天分享的文章在Integrative single cell and spatial transcriptomic analysis reveal reciprocal microglia-plasma cell crosstalk in the mouse brain during chronic Trypanosoma brucei infection，顯然，現(xiàn)在做單細胞空間發(fā)的雜志影響因子都太高了，希望大家好好努力。
這里的重點就是體現(xiàn)配受體分布的空間特性
Abstract
Human African trypanosomiasi或昏睡病是由原生動物Trypanosoma brucei引起的，當(dāng)parasite定植于中樞神經(jīng)系統(tǒng)時，會引起神經(jīng)膠質(zhì)細胞的強烈反應(yīng)和神經(jīng)炎癥。然而，大腦對慢性 T. brucei infected的轉(zhuǎn)錄和功能反應(yīng)仍然知之甚少。通過整合小鼠大腦的單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，發(fā)現(xiàn)由infected觸發(fā)的神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)很容易在腦室周圍器官附近檢測到，包括側(cè)腦室和第三腦室。這與 T. brucei 細長和粗短形式的空間定位相吻合。此外，計算機預(yù)測和功能驗證確定了由 IL-10 和 B 細胞激活因子 (BAFF) 信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細胞和 Cd138+ 漿細胞之間先前未知的crosstalk。
Introduction
單細胞 RNA 測序 (scRNAseq) 的應(yīng)用對理解阿爾茨海默病等腦部疾病具有變革性意義，最近也被應(yīng)用于理解對病毒infected的免疫反應(yīng)。然而，scRNAseq 的一個主要限制是它不能保留起源組織中的空間分布。scRNAseq 與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的整合能夠在區(qū)域和全局范圍內(nèi)表征細胞和組織對infected的反應(yīng)。然而，尚未實施類似的方法來研究組織對原生動物parasite的反應(yīng)。在這里，提出了一個空間分辨的鼠 CNS 單細胞圖譜，以響應(yīng) T. brucei。這種綜合方法發(fā)現(xiàn)由infected引發(fā)的神經(jīng)膠質(zhì)反應(yīng)不僅限于下丘腦，而且在靠近腦室器官 (CVO) 的地方也可以很容易地檢測到，這與 T. brucei 的細長和粗壯形式的定位相吻合。此外，確定了由 IL-10 和 B 細胞激活因子 (BAFF) 信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細胞和 Cd138+ 漿細胞之間以前未知的相互作用。時空圖譜為慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)infected期間先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的相互作用提供了新的見解，并代表了一種資源，可以提高對infected后大腦中觸發(fā)的分子和細胞反應(yīng)的理解.
Results
Single cell transcriptomic analysis of the mouse hypothalamus over the course of T.brucei infection
為了以盡可能多的singularity和空間分辨率解決中樞神經(jīng)系統(tǒng)對 T. brucei infected的反應(yīng)所涉及的不同細胞類型和轉(zhuǎn)錄途徑的復(fù)雜性，采用了結(jié)合單細胞 (scRNAseq) 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法，從采集的樣本中提取中樞神經(jīng)系統(tǒng)階段的開始 (25dpi) 和神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的出現(xiàn) (45dpi)。在這些時間點通過組織學(xué)檢查證實了腦神經(jīng)實質(zhì)和腦膜間隙的整體炎癥。為了進一步完善 scRNAseq 數(shù)據(jù)集，專注于下丘腦，因為它在控制晝夜節(jié)律行為方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用?？偣搏@得了 13,195 個細胞，平均每個細胞有 500 個基因和 1,500 個轉(zhuǎn)錄本/細胞?？傮w而言，確定了跨越 8 種細胞類型的 11 個clusters，包括小膠質(zhì)細胞（clusters 0、1、6 和 9）、少突膠質(zhì)細胞/B 細胞（cluster 7）、星形膠質(zhì)細胞（clusters 2 和 5）、T 細胞（clusters 3）和血管相關(guān)細胞，包括內(nèi)皮細胞（cluster 4）、周細胞（cluster 8）和室管膜細胞（cluster 10）。小膠質(zhì)細胞亞群主要表達putative的標(biāo)志物，包括 C1qa、Lyz2、Aif1 和 Cx3cr1，而星形膠質(zhì)細胞群的特征是成熟星形膠質(zhì)細胞的標(biāo)志物表達，包括 Gfap 和 Agt。血管相關(guān)細胞進一步分為三個 Cldn5+ 內(nèi)皮細胞亞群，兩個代表 Pdgfrb+ 周細胞/tanycytes 的clusters，一個代表 Acta2+ 周細胞的cluster和一個 Ccdc153+ 室管膜細胞cluster。這些數(shù)據(jù)與先前在健康小鼠下丘腦中報道的神經(jīng)膠質(zhì)細胞類型的多樣性一致。
疾病狀態(tài)分析顯示，與na?ve controls 相比，infected樣本中小膠質(zhì)細胞、B 細胞和 T 細胞clusters內(nèi)的細胞分布不同。此外，通過計算基因模塊評分來評估炎癥介質(zhì)（例如細胞因子和趨化因子）的整體表達水平，發(fā)現(xiàn)在小膠質(zhì)細胞中主要觀察到對慢性 T. brucei infected（25 和 45 dpi）的反應(yīng)亞群（特別是小膠質(zhì)細胞 1 和 2），在內(nèi)皮細胞、T 細胞和適應(yīng)性免疫細胞中的程度較低，并且顯著高于na?ve對照（ANOVA，p < 2.2-16）?？傊瑪?shù)據(jù)表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的 T. brucei infected主要在小膠質(zhì)細胞以及 T 細胞和 B 細胞中誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在內(nèi)皮細胞中的程度較低。值得注意的是，沒有在 scRNAseq 數(shù)據(jù)集中檢測到足夠的 T.brucei reads以進行下游分析，這可能是由于腦實質(zhì)中的parasite負(fù)擔(dān)低；然而，能夠在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集中檢測到它們(看來空間的優(yōu)勢還是很大的).
Spatial transcriptomics reveals both T. brucei long slender and stumpy forms predominantly in the circumventricular organs
在分析空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集時，注意到受infected樣本中多個 T. brucei特異性基因的表達，尤其是在 45dpi 時。大多數(shù) T. brucei 特異性基因分布在小鼠前腦的離散位置。例如，通常與細長形式相關(guān)的 Tb927.6.4280 (GAPDH) 在空間clusters 0、1、4、10、14 和 17 中高度表達，這些空間clusters定義了對應(yīng)于大腦尾殼或紋狀體、丘腦的解剖區(qū)域，海馬、大腦皮層、下丘腦和腦室周圍器官（CVO；包括側(cè)腦室和第三腦室）。類似地，Tb927.7.5940 (PAD2) 被限制在clusters 17。parasite在 45dpi 時在這些腦區(qū)的定位至少部分與炎癥介質(zhì)在幾個腦區(qū)（包括cluster 4和cluster 17 周圍）的表達增加一致（兩個與 CVO 相關(guān)的clusters）。使用 smFISH 對與纖細（GAPDH 和 PYK1）或矮胖（PAD2 和 EP1）生命周期階段相關(guān)的parasite特異性標(biāo)記基因和獨立的組織學(xué)評分進一步證實了T. brucei不同發(fā)育階段的空間分布。這些觀察證實，除了通過血腦屏障外， T. brucei還利用 CVO 作為進入 CNS 的點。
為了深入了解腦內(nèi) T. brucei的潛在多樣性，包括不同發(fā)育階段的存在，根據(jù)其相對空間分布對最豐富的 T. brucei轉(zhuǎn)錄本進行了基因GO通路分析?？傮w而言，觀察到 CVO 中通常與代謝活性parasite相關(guān)的基因過多，例如蛋白質(zhì)翻譯 (p adj = 3.35-57) 和生物合成過程 (p adj = 1.05-24)，無論其空間分布如何。此外，CVO 中parasite的轉(zhuǎn)錄組主要受與翻譯（p adj = 9.14-22）、基因表達控制（p adj = 2.23-04）和生物合成過程（p adj = 3.46- 08），表明居住在 CVO 的parasite具有代謝活性。值得注意的是，CVO 中的parasite還表達了被認(rèn)為是parasite分化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的基因，例如 RBP7A 和 RBP7B（分別由 Tb927.10.12090 和 Tb927.10.12100 編碼）、PAD1（由 Tb927.7.5930 編碼）和 PAD2（由Tb927.7.5940) 。Together, these results provide an overview of the spatial distribution of African trypanosomes in the mouse forebrain and support the hypothesis that the majority of brain-dwelling trypanosomes display features of replicative slender forms, protein translation and control of gene expression, together with differentiation commitments in the CVOs.
Infection-associated microglia and border-associated macrophages occupy spatial niches in proximity to the ventricular spaces
確定了小膠質(zhì)細胞在infected時表現(xiàn)出高炎癥評分，并且在 CVO 中或周圍發(fā)現(xiàn)了細長和短粗的 T. brucei 形式，接下來query不同小膠質(zhì)細胞clusters的空間分布是否與前腦中parasite的分布相關(guān)。再亞群分析后，確定了六個離散的骨髓亞群，這些亞群顯示出顯著的差異基因表達特征。例如，cluster 1 和cluster 2 表達高水平的假定穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細胞標(biāo)記基因，包括 P2ry12、Trem119 和 Cx3cr1，并且可能對應(yīng)于不同的穩(wěn)態(tài)subcluster。cluster 1 中的細胞表達高水平的 Tgfbr1、Ifngr1 和 Il6ra，而cluster 2 表達高水平的 Il10ra，表明對細胞因子信號傳導(dǎo)的潛在不同反應(yīng)（例如，cluster 1 中的干擾素 γ (IFNg) 與cluster 2 中的 IL-10 ）。cluster 3 的特點是表達單核細胞特異性譜系標(biāo)記，包括 Cd14、Ccrl2、Fcgr2b 和幾種 MHC-II 相關(guān)分子（H2-Aa1、H2-Ab1）。clusters 4 和 5 表達高水平的 Aif1，以及典型的促炎趨化因子和先天免疫介質(zhì)（Ccl5、Mif、Cxcl13）、補體級聯(lián)的成分（C1qa、C1qb）、抗原加工和呈遞基因（H2- Ab1、H2-Eb1）、幾種干擾素刺激基因（Ifitm3、Ifih1）和疾病相關(guān)小膠質(zhì)細胞的標(biāo)志物（Apoe、Itgax、Trem2、Cst7），但小膠質(zhì)細胞穩(wěn)態(tài)標(biāo)志物的表達降低。最后，cluster 6 表達與邊緣相關(guān)巨噬細胞相關(guān)的推定標(biāo)記基因，例如 Lyz2、Ms4a7、Ms4a6c、Tgfbi、H2-Ab1 和 Lyz2，以及具有抗炎反應(yīng)特征的基因，例如 Chil3、Arg1 和Vegfa，指示抗炎表型?；谶@些結(jié)果，將cluster1 到 6 分類如下：Cx3cr1+ 1 (29.5%)、Cx3cr1+ 2、(30.4%)、Cd14+ 單核細胞 (27.6%)、Arg1+ 邊界相關(guān)巨噬細胞 (Arg1+ BAM；12.6%)、Aif1+ 1 (10.5%)、Aif1+ 2 (4.85%)。值得注意的是，Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細胞 1 和 2，以及 Cd14+ 單核細胞占在穩(wěn)態(tài)條件下檢測到的所有小膠質(zhì)細胞的約 75%，但 Aif1+ 小膠質(zhì)細胞 1 和 2，以及 Arg1+ BAMs 亞群在infected過程中的頻率逐漸增加，表明采用infected相關(guān)的表型。在空間背景下，發(fā)現(xiàn) Aif1、Adgre1（Aif1+1 和 Aif1+2 subcluster的特異性標(biāo)記基因）的基因表達在 25dpi 和 45dpi 時在海馬體、CVO 和尾殼核周圍高度表達，與幼稚對照相比。同樣，Arg1 + BAM 的推定標(biāo)記基因 Arg1 和 Chil3 主要位于受infected大腦的側(cè)腦室和背側(cè)第三腦室，通過對獨立腦切片的免疫熒光分析進一步證實。總之，綜合分析表明，在靠近 CVO 的區(qū)域檢測到infected相關(guān)的骨髓亞群（Aif1+1、Aif1+2 和 Arg1+BAM），與 T. brucei的空間分布相一致，并suggesting a functional compartmentalisation of the myeloid subsets in responses to infection。
Microglial responses to T. brucei infection share common transcriptional features with neurodegeneration diseases
為了在分子水平上更全面地了解小膠質(zhì)細胞對infected的反應(yīng)，分析了小膠質(zhì)細胞亞型響應(yīng) T. brucei infected的差異表達基因 (DEG)，定義為 Log2 倍數(shù)變化 >0.25 或 <-0.25 的基因調(diào)整后的 p 值 < 0.05。大多數(shù)上調(diào)的 DEG 在 Cx3cr1+ 1、Cx3cr1+ 2 和 Cd14+ 單核細胞亞群中檢測到，并且與 MHC-II 介導(dǎo)的抗原呈遞（iH2-Aa1、H2-Ab1）、中性粒細胞趨化性（Ccl2、Ccl4）的上調(diào)有關(guān)、適應(yīng)性免疫反應(yīng)（Cd274、Mif、Tnfsf13b）和對 IFNg 的反應(yīng)（Ifitm3、Aif1）。隨著infected的進展，我們注意到與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的基因通路富集，包括肌萎縮側(cè)索硬化癥、亨廷頓病、帕金森病和阿爾茨海默病，包括 Apoe、Trem2、Psen2 和 Cd22。這些細胞還下調(diào)與器官發(fā)育（Tgfbr1、Mertk、Fos）、神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)（Cx3cr1、Itgam）和對 cAMP 的反應(yīng)相關(guān)的穩(wěn)態(tài)過程?？傮w而言，數(shù)據(jù)證明了在 T. brucei infected期間小膠質(zhì)細胞的動態(tài)反應(yīng)。在 CNS 階段 (25dpi) 開始期間，穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細胞上調(diào)與抗原加工、呈遞和適應(yīng)性免疫反應(yīng)發(fā)展相關(guān)的轉(zhuǎn)錄程序，同時下調(diào)與穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因。隨著infected的進展（45dpi），小膠質(zhì)細胞特征與神經(jīng)退行性疾病中發(fā)現(xiàn)的特征有許多共同點，與這些動物臨床癥狀的發(fā)展相吻合。這些數(shù)據(jù)表明對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥過程的常見轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。其他骨髓細胞類型，例如 Cd14+ 單核細胞和 Arg1+ BAM，構(gòu)成了對infected的額外反應(yīng)者，盡管具有相反的效果； Cd14+ 單核細胞和 Arg1+ BAM 分別顯示促炎和抗炎表型。
Chronic T. brucei infection recruits follicular-like regulatory Cd4+ T cells and cytotoxic Cd8+ T cells into the CNS
接下來，試圖表征數(shù)據(jù)集中識別的適應(yīng)性免疫細胞群。根據(jù) T 細胞標(biāo)記基因（如 Trac 和 Cd3g）的表達鑒定了三個 T 細胞亞群。由于缺乏可識別的標(biāo)記基因，cluster 0 (44%) 被丟棄。cluster 1 (18%) 和 2 (18.5%) 表達與細胞毒性 T 細胞相關(guān)的標(biāo)記基因，例如 Cd8a 和 Gzmb。cluster 2 中的細胞還表達高水平的與細胞毒性 T 細胞活化和效應(yīng)功能相關(guān)的基因（Ccl5、Klrd1）、γ TCR 受體亞基（Trgv2）、干擾素刺激基因（Ifitm1）和高水平的 Cd52，其中涉及在 T 細胞效應(yīng)功能中。這表明cluster 2 中的細胞可能代表一個專門的細胞毒性 T 細胞亞群。最后，除 Cd4 外，cluster 3 中的細胞（18.5%）表達高水平的與調(diào)節(jié)性 CD4+ T 細胞相關(guān)的基因，包括表面標(biāo)志物（Cd5、Ctla4、Icos、Cd274）、轉(zhuǎn)錄因子（Mxd1、Izkf2）和效應(yīng)分子（Il10、Areg、Il21）。值得注意的是，這些調(diào)節(jié)性 Cd4+ T 細胞還表達高水平的標(biāo)記基因，這些基因通常與濾泡輔助 T 細胞如 Maf 和 Slamf5 相關(guān)。這些濾泡樣調(diào)節(jié)性 CD4+ T 細胞亞群已被假定為淋巴器官適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，但迄今為止尚未在infected期間在大腦中報告。這些population在infected過程中似乎是動態(tài)的，與其他亞群相比，慢性階段與 Cd4+ T 細胞的豐度增加了兩倍（幼稚、25dpi 和 45dpi 分別為 8.2%、19.3% 和 20.85%） )，與之前的報道一致。值得注意的是，被鑒定為cluster 2 Cd8+ T 細胞（Cd8+ 2 T 細胞）的亞群僅在infected樣本中檢測到，但在幼稚對照中未檢測到（在 25 dpi 和 45dpi 時分別為 23% 和 20%），表明存在與疾病相關(guān)的 T 細胞大腦中的子集。在空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)集中對整個大腦進行比較時，Cd4+ T 細胞亞群主要在幼稚和infected樣本的側(cè)腦室、外囊和尾殼中檢測到，而 Cd8+ T 細胞亞群在腦實質(zhì)。
與幼稚對照相比，使用 NicheNet 的細胞間相互作用分析揭示了infected樣本中 T 細胞、基質(zhì)細胞和脈管系統(tǒng)之間的分子通訊網(wǎng)絡(luò)。例如，室管膜細胞和內(nèi)皮細胞分別表達高水平的 Cxcl10 和 Cxcl12，它們是神經(jīng)炎癥期間淋巴細胞募集到腦實質(zhì)的關(guān)鍵介質(zhì)。小膠質(zhì)細胞還表達其他趨化因子亞群（Ccl2、Ccl3、Ccl4），與在血管相關(guān)細胞中檢測到的沒有重疊，這可能表明infected期間 T 細胞募集到腦實質(zhì)的非冗余機制。此外，內(nèi)皮細胞和小膠質(zhì)細胞表達高水平的細胞粘附標(biāo)志物，包括 Icam1、Icam2 和 Pecam1，它們介導(dǎo)免疫細胞跨內(nèi)皮和血管外組織遷移。還檢測到 T 細胞活化的其他介質(zhì)，包括內(nèi)皮細胞衍生的 Il15 和星形膠質(zhì)細胞衍生的 Il18，它們參與 T 細胞活化和增強 IFNg 產(chǎn)生?？傊?，數(shù)據(jù)提供了慢性 T.brucei infected期間 CNS 中 T 細胞多樣性的概述，包括在 T. brucei infected過程中在大腦中積累的調(diào)節(jié)性 Cd4+ T 細胞。此外，配體-受體介導(dǎo)的細胞-細胞通訊表明，小膠質(zhì)細胞、室管膜細胞、內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞在慢性 T. brucei病期間參與了 T 細胞向大腦的募集和激活，盡管通過不同的信號分子.
Cd138+ plasma cells are detected in the mouse brain during chronic T. brucei infection
接下來，表征 cluster 7中表達的基因的細胞。這似乎代表了表達高水平的少突膠質(zhì)細胞標(biāo)記物（olig1，Sox10和S100b）和Bona vide b細胞標(biāo)記物（CD79a，CD79b，ighm的細胞的異質(zhì)分組）。subcluster 7 后的降維分析使我們確定了五個clusters，如下所示：cluster 1 (34.7%) 和 2 (11.41%) 表達高水平的 Olig1 和 Pdgfra 并對應(yīng)于少突膠質(zhì)細胞，cluster 3 (8.48%) 對應(yīng)于 Epcam+神經(jīng)上皮和由 Map2+ 神經(jīng)元組成的cluster 4 (6.02%)。最后，除了 Cd79a 和 Cd79b（編碼 B 細胞受體）外，cluster 0（39.3%）的特征還在于與漿細胞相關(guān)的推定標(biāo)志物的高表達水平，包括表面標(biāo)志物（Sdc1 或 Cd138、Slamf7）和漿細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Prdm1、Xbp1、Irf4）。這些細胞還表達與調(diào)節(jié)功能相關(guān)的基因，包括 Il10 和 Cd274，因此被標(biāo)記為 Cd138+ 漿細胞。此外，在初始對照中檢測到低水平的 Cd138+ 漿細胞（該cluster中約 8% 的細胞），但在 25dpi（61.6%）和 45dpi（88%）的infected過程中增加。在獨立的體內(nèi)實驗中，流式細胞術(shù)進一步證實了慢性infected期間 Cd138+ 漿細胞的富集，反映了 scRNAseq 檢測到的比例。值得注意的是，Cd138+ 血漿在 CVO（背側(cè)第三腦室）和底丘腦區(qū)域周圍的幼稚大腦中占據(jù)離散的壁龕，但在 25dpi 時優(yōu)先在外囊、胼胝體和側(cè)腦室或軟腦膜、扣帶回皮層、側(cè)腦室中檢測到心室和背側(cè)第三腦室在 45dpi。結(jié)合流式細胞術(shù)的結(jié)果，這些數(shù)據(jù)表明該群體在 CVO 和近端區(qū)域的潛在擴張。此外，Il10 的預(yù)測表達，一種顯示在具有調(diào)節(jié)表型的 B 細胞中表達的抗炎細胞因子，是通過 ELISA 對來自infected小鼠的離體刺激腦內(nèi) B 細胞進行了測試和證實，證實了計算機數(shù)據(jù)并表明了調(diào)節(jié)表型。總之，這些數(shù)據(jù)顯示在慢性 T. brucei infected期間，小鼠大腦中 CVO 和軟腦膜中存在具有調(diào)節(jié)表型的 Cd138+ 漿細胞.
Cd138+ plasma cell supernatant suppresses microglia polarisation towards an inflammatory phenotype
scRNAseq 數(shù)據(jù)表明， T. brucei infected小鼠前腦中的小膠質(zhì)細胞同時表達 Il10ra 和 Il10rb（它們共同形成功能性 IL-10 受體，并且當(dāng)離體刺激時，大腦中的 Cd138+ 漿細胞會產(chǎn)生 IL-10。因此，假設(shè)漿細胞衍生的 IL-10 可能在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的促炎反應(yīng)中發(fā)揮作用。在 CVO 周圍的計算機空間配體-受體相互作用分析中，確定了infected期間上調(diào)的幾種重要配體-受體相互作用，包括 Clec1b-Klrb1c，參與調(diào)節(jié) NK 細胞介導(dǎo)的細胞溶解活性和 Lpl-Lrp2，它們參與 ApoE 介導(dǎo)的神經(jīng)元中膽固醇攝入。此外，還發(fā)現(xiàn) Il10 和 Il10ra 在 CVO 和軟腦膜中的強共表達，與預(yù)測 Cd138+ 漿細胞在 45dpi 時的定位，這已使用單分子熒光原位雜交 (smFISH) 進行了獨立驗證。 Il10 在腦內(nèi) Cd138+ 漿細胞中的表達和 Il10ra 在穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細胞中的表達。接下來，假設(shè)來自受刺激的 Cd138+ 漿細胞的上清液也可能阻止小膠質(zhì)細胞極化向促炎狀態(tài)。正如預(yù)期的那樣，暴露于大腸桿菌 LPS 24 小時的 BV2 小膠質(zhì)細胞樣細胞表達高水平的促炎細胞因子 Il1b 和 Tnfa，當(dāng) BV2 細胞暴露于 Cd138+ 漿細胞的上清液時，這種細胞因子被消除。此外，用抗 IL-10 的阻斷抗體預(yù)處理 Cd138+ 漿細胞上清液可恢復(fù) BV2 小膠質(zhì)細胞中 Il1b 和 Tnfa 的表達，強烈表明 IL-10 是一種關(guān)鍵的漿細胞衍生的抗炎調(diào)節(jié)劑。總之，這些數(shù)據(jù)表明 Cd138+ 漿細胞和小膠質(zhì)細胞之間的功能相互作用至少部分由 IL-10 信號傳導(dǎo)介導(dǎo).
Cx3cr1+ microglia express the B cell pro-survival factor B cell activation factor (BAFF) signalling
在確定小膠質(zhì)細胞、T 細胞和漿細胞與慢性 T. brucei infected有關(guān)后，接下來決定根據(jù)典型配體-受體對的表達水平評估相關(guān)的細胞-細胞相互作用。其中，觀察到漿細胞和小膠質(zhì)細胞之間復(fù)雜的分子通訊網(wǎng)絡(luò)。在來自 Cx3cr1+ 1、Cx3cr1+ 2 和 Arg1+ BAM（Vcam1、Spp1 和 Agt）的小膠質(zhì)細胞中冗余檢測到一組配體，而第二個配體子集顯示出更多的細胞限制性表達譜。例如，促存活因子 Tnfsf13b（編碼 B 細胞存活因子，BAFF）在infected后被穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細胞大量上調(diào)，而其同源受體 Tnfrsf17（或 B 細胞成熟抗原，BCMA）的表達高度在infected動物的 Cd138+ 漿細胞中表達。此外，infected小鼠的小膠質(zhì)細胞中 Tnfsf13b 的表達更高，這表明這種 B 細胞促生存因子是在infected后誘導(dǎo)的。基于共表達的空間配體-受體相互作用分析表明，促生存因子基因 Tnfsf13b 及其受體基因 Tnfrsf17 的共表達僅限于 CVO 和軟腦膜，如Il10-Il10ra 配體-受體對。這兩個基因的表達模式由 smFISH 分析獨立證實，并顯示表達 Tnfrsf17 的漿細胞與表達 Tnfsf13b 的小膠質(zhì)細胞非常接近，特別是在 T. brucei infected小鼠大腦的側(cè)腦室附近。通過流式細胞術(shù)實驗進一步分析了infected后小膠質(zhì)細胞中 BAFF 的表達，證實了計算機預(yù)測?？傊?，數(shù)據(jù)表明小膠質(zhì)細胞和 Cd138+ 漿細胞之間存在串?dāng)_。在這種情況下，Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細胞通過 BAFF 促進 Cd138+ 漿細胞存活，進而 Cd138+ 血漿產(chǎn)生 IL-10 以抑制 T. brucei infected期間小膠質(zhì)細胞的炎癥反應(yīng)。
Discussion
為了解決有關(guān) CNS 對未解決的慢性 T. brucei infected的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的基本問題，本研究有三個主要目標(biāo)：i) 使用單細胞表征膠質(zhì)細胞和募集的免疫細胞對 CNS 的時間轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 轉(zhuǎn)錄組學(xué)，ii) 使用 10X Visium 空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)從 scRNAseq 數(shù)據(jù)集中了解候選細胞類型的空間分布，以及 iii) 基于假定的配體-受體相互作用模擬慢性infected期間 CNS 中發(fā)生的細胞-細胞相互作用 細胞和空間水平。 我綜合圖譜為未來分析 T. brucei對慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)infected的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)提供了新穎而重要的見解
數(shù)據(jù)描述了與慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)infected相關(guān)的關(guān)鍵細胞類型和細胞間相互作用。我們證明了小膠質(zhì)細胞在 CNS 中驅(qū)動炎癥和抗parasite反應(yīng)，并且還提供了對邊界相關(guān)巨噬細胞 (BAM) 轉(zhuǎn)錄特征的見解。這些反應(yīng)是異質(zhì)的，小膠質(zhì)細胞和 Cd14+ 單核細胞表現(xiàn)出強烈的促炎特征。它們的轉(zhuǎn)錄程序與預(yù)期在發(fā)病期間響應(yīng)致病性挑戰(zhàn)而觸發(fā)的促炎反應(yīng)一致，包括細胞因子（即 Il1b、Tnf）、趨化因子（即 Ccl5、Cxcl10）的產(chǎn)生和分子的上調(diào)與抗原加工和呈遞有關(guān)?；趇nfected過程中的差異基因表達分析，我們提出了一個模型，其中穩(wěn)態(tài) Cx3cr1+ 小膠質(zhì)細胞在infected期間經(jīng)歷廣泛的轉(zhuǎn)錄重塑，導(dǎo)致獲得與infected相關(guān)的表型，這與臨床癥狀的發(fā)作相吻合。這包括在檢測到臨床癥狀的infected點上調(diào)涉及其他神經(jīng)退行性疾病的基因程序，例如 Apoe、Trem2 和 Cd22。在 IAMs 狀態(tài)中確定的轉(zhuǎn)錄特征讓先前在神經(jīng)退行性疾病中報道的那些，因此很容易推測這代表了一個核心的“病理”轉(zhuǎn)錄模塊，它在小膠質(zhì)細胞中被觸發(fā)以響應(yīng)insults，而不管這種情況的性質(zhì)如何insults。這些相似性為慢性腦炎癥背后的機制提供了新的見解。
Method(關(guān)注一下單細胞空間聯(lián)合)
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