多重免疫組化 (mIHC)！額......和 mIHC 差不多的那個？是的，Buuuut！二者在具體實操中仍存在許多不同，嗯~就是那種~微妙的不同~讓我們一起來看看吧~
Section.01
什么是 mIHC？
多重免疫組織化學(Multiplex immunohistochemistry，mIHC)，也稱為酪氨酸信號放大技術(TSA)，通過在單個組織切片上同時染色多種免疫標記物，增強了單個組織切片中可觀察到的信息量，因此可成為直接在腫瘤微環(huán)境中可視化細胞相互作用的有力工具[1]。
mIHC 的原理
mIHC 借助不同的熒光染料標記，通過多輪染色實現組織或細胞的多靶點染色。利用二抗上帶有的 HRP 來催化加入體系的非活性熒光素，以生成活化的熒光底物。活化的熒光底物可與抗原的酪氨酸共價結合，將信號以共價結合的方式結合到抗原上。這種分子結合產生的熒光信號比傳統(tǒng)的免疫結合產生的熒光信號維持時間更久。后續(xù)進行抗修復洗去非共價結合的抗體，并暴露出抗原以進行下一輪的結合。待所有抗體孵育結束且熒光素都結合好后，對結果進行檢測[2]。
Section.02
mIHC 完整實驗步驟
樣本制備
(1)取材：在采集動物或人體的組織樣本時，需特別注意控制組織塊的體積，使其保持在適當范圍內，以確保固定液能夠均勻且完全地滲透至組織內部。
(2) PBS?/生理鹽水沖洗：去除組織樣本中帶有的血液或者其他可能影響固定效果的體液。
(3) 固定：用 10% 福爾馬林、甲醇、乙醇或者它們的混合液室溫固定 18-24 小時，需要確保組織樣本完全浸入固定液，避免出現未固定部分。
(4) 固定后處理：流水沖去固定液。
包埋
常用的包埋介質包括石蠟、樹脂等。以石蠟為例。
(1) 脫水：酒精梯度脫水，用 75% 乙醇、85% 乙醇、95% 乙醇、無水乙醇(I)、無水乙醇(II)分別浸泡 30-60 min，此時樣本會變得不透明。
(2) 透明：用透明劑?(如二甲苯)浸泡兩次，每次 30 min 以去除酒精和其他溶劑。注意避免透明過度導致樣本變硬易碎。
(3) 浸蠟：將經過透明處理的組織樣本浸入熔融石蠟中，置于恒溫箱內進行浸透，使石蠟充分而均勻地滲入組織內部。
(4) 包埋：將浸蠟后的組織樣本放入模具，倒入熔化的石蠟。等待石蠟冷卻凝固，避免過度冷卻導致石蠟碎裂或組織變形。
切片
(1) 切片：將包埋后的組織樣本用切片機切成 4-5 μm 厚的薄片。
(2) 展片烤片：用細毛刷輕柔地將切片從切片刀上分離，隨后置于 40℃ 溫水中使其充分展平，最后在 60℃ 條件下烘烤 2 小時以增強切片附著力。
脫蠟復水
(1) 脫蠟：依次使用二甲苯 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 進行梯度脫蠟，每缸浸泡 5 分鐘。徹底清除石蠟對后續(xù)實驗至關重要，任何殘留都將干擾抗原暴露及染色效果。
(2) 復水：采用梯度乙醇（100% 乙醇 Ⅰ、100% 乙醇 Ⅱ、95% 乙醇、85% 乙醇、70% 乙醇）依次脫水，每級作用 5 分鐘；最后經純化水浸洗 5 分鐘完成水化過程。注意需要避免干片，干片會導致非特異性抗體結合出現高背景。
抗原修復
通過抗原修復技術暴露被封閉的抗原表位，以增強抗體結合效率。熱誘導抗原修復是最常用的方法，推薦使用以下修復緩沖液：檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)、EDTA 緩沖液(pH 8.0)或 Tris-EDTA 緩沖液(pH 9.0)。其中，EDTA 和 Tris-EDTA 緩沖液可以在檸檬酸鹽緩沖液使用效果不好時使用，但需注意在高表達樣本中可能產生非特異性染色?？梢远鄧L試幾種修復方法以達到最佳染色效果。
(1) 微波熱修復：加入抗原修復液，放入切片，置于微波爐中火 8 min，?；?7 min，轉小火 8 min；取出染色盒，冷卻至室溫。
(2) 水浴熱修復：加入抗原修復液，放入切片，置于水浴鍋中 95℃ 恒溫 25-30 min(注意控制溫度避免沸騰，以防組織脫落)。將樣片與水共冷，不可驟冷避免快速降溫導致抗原表位構象改變。
(3) 高壓熱修復：在染色盒中加入抗原修復液，放入切片，置于高壓鍋內加熱至飽壓后繼續(xù)加熱 5 min，關閉電源，10 min 后取出染色盒，冷卻至室溫。
(4) 酶解修復：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K 等。將切片置于含有酶解液的載玻片上，然后在適當的溫度和濕度條件下進行酶解(通常為 37°C，20 min)。酶解后，同樣需要冷卻切片至室溫再進行后續(xù)處理。修復后用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。
阻斷
(1) 阻斷：采用 3% H2O2溶液室溫避光孵育樣本 15 分鐘，以消除內源性過氧化物酶活性，避免其對后續(xù) HRP 顯色系統(tǒng)的干擾。
(2) 洗滌：用 ddH2O 清洗切片兩次，每次 5 min。用 PBS 在搖床上洗 1 遍，每次 5 min。
封閉
(1)?封閉：用組化筆圈出玻片上的樣本區(qū)域，滴加封閉液，用封閉液(5%?BSA?或者血清)?室溫或者 37℃ 孵育 30 min。
(2) 洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。
一抗孵育
(1)一抗稀釋：選擇合適的一抗，并用稀釋液(PBS、TBS 等)?稀釋一抗至合適的比例。
(2) 一抗孵育：使用移液器將稀釋后的一抗均勻覆蓋樣本區(qū)域，置于濕度平衡的孵育盒中，37℃ 恒溫孵育 90 分鐘以促進抗原-抗體特異性結合。
(3) 洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。針對易脫片樣本，采用 37℃ 預溫的溫和洗脫緩沖液，輕柔洗滌 5-20 分鐘，以維持組織完整性同時有效去除非特異性結合。
二抗孵育
(1) 二抗稀釋：選擇合適的二抗，并用稀釋液(PBS、TBS 等)稀釋二抗至合適的比例。
(2) 二抗孵育：室溫孵育二抗 1 h，注意避光和干片。
(3) 洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。
TSA 染料孵育
(1) 稀釋 TSA：用 1×TSA buffer 以 1:50-1:200 稀釋 TSA 染料配置成工作液。染色液在室溫下避光保存，最長可保存 24 h。
(2) 在玻片上滴加 100 μL 染色工作液，浸沒樣本，室溫搖床上孵育 5-10 min，注意避免干燥。
(3) 洗滌：用 PBS 在搖床上洗 3 遍，每次 5 min。
抗體脫落
步驟同上述抗原修復步驟，目的是洗去已孵育的抗體。
冰凍切片/細胞爬片/骨組織(容易脫片)建議滴加適量 37℃ 預熱至完全溶解的 mIHC 專用抗體洗脫液均勻覆蓋樣本，37℃ 放置 ?5-20 min，棄洗脫液，再次滴加適量抗體洗脫液均勻覆蓋樣本，37℃ 放置 5-20 min。
洗滌
ddH2O 洗一次，PBS 浸片 2 min。
重復
封片或者繼續(xù)染色，可從步驟 "阻斷封閉" 開始。重復步驟包括阻斷內源性過氧化物酶—封閉 — 一抗孵育 — 二抗孵育 — TSA 熒光染料染色 — 抗體洗脫。
核染和封片
滴加 DAPI 工作液到樣本上，室溫孵育 5 min，PBS 洗滌一次，用抗熒光淬滅封片劑封片。長期保存建議用透明指甲油對蓋玻片邊緣進行密封。
鏡檢拍照
切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。
Section.03
mIHC 注意事項
(1) 建議在進行多重免疫染色前先通過預實驗評估各抗體的染色效能，優(yōu)先對染色信號較弱的靶抗原進行標記，再依次進行其他抗原的染色。
(2) 染料充分溶解混勻，表達高的一抗搭配弱光，表達低的搭配強光。
(3) 組織所包含細胞數應大于 1,000 個。
(4) 沒有一種抗原修復緩沖液可以適用于所有抗原。不同的抗體可能需要不同的抗原修復方法和條件，因此需要根據實驗要求和抗體特性選擇合適的抗原修復方法。
(5) 實驗過程中注意保持濕潤狀態(tài)，避免干片，易引起高背景或者出現陰陽片。
(6) 福爾馬林固定的樣本，對于石蠟包埋樣本，應確保組織塊完整性，無可見裂隙或結構破損。組織芯片(TMA)?蠟塊需保持包埋基質完整，避免切割或封固缺陷。載玻片上的切片應呈現連續(xù)完整的組織結構，無折疊或碎裂現象。
(7) TSA 熒光染料工作液 = VF 熒光染料 + TSA buffer；推薦熒光染料和 TSA buffer 的稀釋比為 1:200；稀釋比例可以根據具體情況靈活調整優(yōu)化，最佳范圍為 1:50-1:400；一般建議若一抗孵育時間常溫 1 h-3 h 內，建議稀釋比例 1:50-1:200，若一抗孵育時間 4℃ 過夜(12 h 或以上)，建議稀釋比例 1:200-1:400 或更高。
(8) 使用幾種熒光素時，盡量選擇相互之間無光譜交叉的熒光素，降低標記熒光強度，樣品的一種或幾種熒光強度太高，有時會導致光譜交叉出現。采用降低標記物濃度、縮短標記時間及調整熒光素介質等方法可降低樣品熒光強度。
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mIHC 常見問題
Q?多重染色試劑盒可以做細胞/細胞爬片樣本嗎？
A?可以的，但是每輪之間的修復建議換成抗體洗脫液。另外爬片不建議做五色以上，爬片多次修復會無信號反應。
Q?試劑盒對一抗二抗種屬有要求嗎？
A?支持 IHC-P，選擇特異性高的一抗抗體。一抗種屬盡量遠離實際樣本種屬，避免二抗帶來的非特異性。試劑盒內有搭配二抗，可以根據二抗來選擇一抗的來源。多色的優(yōu)勢在于一二抗種屬無需特別要求，一抗根據樣本種屬選擇既可，二抗根據一抗選擇即可，多個抗體組合，種屬不會有影響。
Q?可以用同一來源的一抗進行染色嗎？
A?可以的，TSA 的優(yōu)點之一就是可以用于同一來源的一抗進行多重染色。
Q?是否可以用自己的二抗？
A?可以的，能夠對應自己的一抗的 HRP 二抗就可以。
Q?標本切片有刀痕褶皺怎么辦？切片易脫片怎么辦？
A?切片有刀痕可換個刀口切片或者將蠟塊置于 -20℃ 冰凍一會在切。切片有皺褶，要求撈片的時候片子充分展片，可在臺燈下觀察，展片溫度控制在 40℃ 左右。切片容易脫片可將玻片用多聚賴氨酸處理，以增強粘附性。
Q?脫蠟不全，組織出現異染現象怎么辦？
A?根據不同的室溫，調節(jié)脫蠟的時間，原則是要徹底，干凈。一般夏天室溫高，脫蠟時間不需要很多 3-5 min 即可。冬天室溫較低，脫蠟時間需要延長，10-20 min 或更長。
Q?如何降低非特異性染色？
A?縮短一抗/二抗孵育時間，稀釋抗體比例。多克隆一抗容易出現背景，可以用單克隆抗體。內源性過氧化氫酶在肝臟和腎臟等組織含量較高，需要延長阻斷時間減少背景。非特異性組分和抗體結合，需要延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間。適當增加 PBS 洗滌次數和時間。實驗過程中防止干片。
Q?熱修復每一輪都要做嗎？
A?第一次染抗體之前的叫做抗原修復，是為了使被石蠟或者固定劑封閉的抗原決定簇重新暴露出來，使得抗體能夠識別到抗原。在染后面幾輪抗體之前的抗原修復，目的是為了去掉上一輪染色的抗體以及殘留沒有結合上的染料。如果是新鮮的冰切，可以不做抗原修復但仍需要阻斷內源性過氧化物酶。如果是固定組織的冰凍切片仍需要做抗原修復，但是冰凍切片加熱會有脫片風險，所以我們一般不建議固定樣本的客戶轉做冰切。另外冰切樣本可以用抗原洗脫液進行處理。
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mIHC 技術服務
mIHC 產品推薦-多重熒光檢測試劑盒
mIHC MCE 承接服務
提供有償代檢和分析服務
承接多色配套服務
參考文獻
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