1.序列比對
2.DNA-seq&RNA-seq
3.幾款比對工具的比較
4.基因組變異
5.變異檢測工具的選擇
6.參考
????序列比對
????目前的生物信息分析流程離不開序列比對，基于比對結(jié)果才能進行后續(xù)相關(guān)分析（組裝、變異檢測等）。可以說，序列比對已經(jīng)成為生物信息分析的基石。根據(jù)不同應(yīng)用，序列比對大致可以分為三類：
????1）全局比對，常用軟件有 Clustal Omega、MUSCLE、HMMER 等，主要用于多序列比對、種系分析、保守區(qū)段分析等；
????2）局部比對，常用軟件有 Blast+、Blat、Blastz、GeneWise 等，主要用于同源序列分析、數(shù)據(jù)庫比對、基因功能注釋等；
????3）短序列比對，常用軟件有 BWA、Bowtie2、SOAP2、NovoAlign、TopHat、STAR、HISAT2 等，主要用于將高通量測序產(chǎn)出的短片段（Reads）快速且準確地比對到參考序列上。
????DNA-seq & RNA-seq
????大家在對比對工具進行比較時，喜歡將其分為DNA比對工具（DNA-seq）和RNA比對工具（RNA-seq）。它們的區(qū)別僅在于是否會考慮跨外顯子的比對，即：是否會將沒有比對上的reads劈開，對劈開后的兩部分再次比對）。
????隨著現(xiàn)在各種seq的出現(xiàn)，我們已經(jīng)不能簡單的根據(jù)是比對DNA還是RNA來判斷工具的選擇，而是要判斷reads的比對是否需跨外顯子。比如PRO-seq/GRO-seq，它們在建庫時捕獲的RNA，但是它們并不需要考慮跨外顯子的比對。
? ??常用工具：
DNA-seq：bowtie；bowtie2；BWA
RNA-seq：STAR；HISAT2；Tophat
????HISAT2不僅支持RNA-seq的比對還支持DNA-seq比對，唯一需要做的就是加上一個參數(shù)--no-spliced-alignment。但是就目前來看，大部分人都是使用HISAT2做RNA-seq，沒人使用它做DNA-seq
????STAR是ENCODE皇家御用的RNA-seq比對工具，ENCODE計劃(ENCyclopedia Of DNA Elements)又稱人類基因組DNA元件百科全書計劃，是2003年在人類基因組計劃完成之后緊接著的又一個大型國際科研項目。
? ??幾款比對工具的比較
????可能是因為RNA-seq分析比較大眾，因此大部分的比對工具都是利用RNA-seq的效率進行比較。對于 DNA-seq，最常用是 BWA；對于 RNA-seq，目前用的較多的是 HISAT2。
? ??無論是HISAT2還是STAR，對于Tophat來說都有很大的優(yōu)勢，Tophat已不再繼續(xù)更新，所以我們不再使用它。
????對 RNA-seq 產(chǎn)出的數(shù)據(jù)進行變異檢測分析，與常規(guī)重測序的主要區(qū)別就在序列比對這一步，因為 RNA-seq 的數(shù)據(jù)來自轉(zhuǎn)錄本，比對到參考基因組需要跨越轉(zhuǎn)錄剪切位點，所以 RNA-seq 進行變異檢測的重點就在于跨剪切位點的精確序列比對。GATK 發(fā)布的 RNA-seq 數(shù)據(jù)變異檢測最佳實踐流程用了 STAR 2-pass 這一方法進行序列比對，STAR 比對速度還算挺快。
????推薦文獻：Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Systematic evaluation of spliced alignment programsfor RNA-seq data
? ??HISAT2，找到j(luò)unction正確率最高，但是在總數(shù)上卻比TopHat和STAR少，二類錯誤(納偽）比較少，一類錯誤（棄真）有點高，靈敏度相對較低。STAR靈敏度更高，但是會有許多包含soft-clip的低質(zhì)量比對，即對lower-quality（包括more soft-clipped和錯配堿基）比對有較高的容忍度。
? ? （?junction：轉(zhuǎn)錄組reads比對不同于基因組reads比對(如ChIP-seq、WES等)的地方在于，比對的reads可能來源于2個被內(nèi)含子隔開的外顯子區(qū)域，導(dǎo)致reads一端比對在第一個外顯子的后面部分，另一端比對在第二個外顯子的前面部分，即跨剪切位點，從而形成exon-exon junction (剪接點)。這些reads又稱為junction reads，對轉(zhuǎn)錄本的拼接、鑒定和差異分析具有重要的意義。）
? ? （soft-clip事件: 即reads末端存在低質(zhì)量堿基或接頭導(dǎo)致比對不上的， STAR會自動嘗試截去未比對部分，只保留比對上的部分。）? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
? ??STAR的unique mapping比例最高，它對于雙端測序的reads，要么全部比對上，要么全部拋棄，不會像TopHat和HISAT2一樣只比對上某一個reads，即STAR相比較其他兩款軟件有較高的唯一比對率
????就唯一比對而言，STAR是三者最佳的，主要是因為它不會像TopHat和HISAT2一樣在PE比對不上的情況還強行把SE也比對到基因組上。而且在處理較長的read和較短read的不同情況，STAR的穩(wěn)定性也是最佳的。就速度而言，在比對速度方面，HISAT2比STAR快2.5倍，比TopHat快大約100倍。
????推薦一個網(wǎng)站，這里介紹了幾種不同比對軟件的使用方法（bowtie2, bwa, STAR, Tophat四種）：homer。
在HOMER網(wǎng)站上，對幾種比對軟件進行的說明，可以看到STAR的速度是最快的，當然得保證有這么多的內(nèi)存來運行：
bowtie: fast, works well
bowtie2: fast, can perform local alignments too
BWA- Fast, allows indels, commonly used for genome/exome resequencing? 快速，允許indels，通常用于 基因組/外顯子組 重測序
Subread- Very fast, (also does splice alignment)
STAR- Extremely fast (also does splice alignment, requires at least 30 Gb memory)
? ??BWA mem算法產(chǎn)生的SNP 比bowtie2的高很多，大多數(shù)的variant calling的pipeline中都會推薦使用BWA比對工具。
? ??基因組變異
????http://www.itdecent.cn/p/4453e58a9c96
? ??變異檢測工具的選擇
? ??GATK的HaplotypeCaller在精度和準確上都比FreeBayes, Platypus 和samtools?好。
? ??samtools 在找indels更加的粗獷，找到了更多本來不存在的indels，但是在SNP上的表現(xiàn)其實是一致的。Samtools+bcftools 能Call SNP，速度會比GATK快。
? ??GATK 能夠利用機器學(xué)習(xí)的方法根據(jù)已有變異數(shù)據(jù)庫進一步提高結(jié)果的準確度。但是對于植物而言，所能做的也就是硬指標過濾。因此，如果做人類，最推薦的工具是GATK，因為表現(xiàn)的確很好。而且人類還會不斷增加樣本，需要使用GVCFs文件解決N+1的問題。如果是植物，可以考慮freebayes，效率高，表現(xiàn)也不錯。
? ??xuzhougeng 推薦閱讀這篇文獻 "Single Nucleotide Polymorphism Identification in Polyploids: A Review, Example, and Recommendations"。
聲明：本篇多為資料整理總結(jié)，僅用于自學(xué)記錄和交流，侵刪，謝謝。參考：
參考
https://www.bioinfo-scrounger.com/archives/288/
http://www.itdecent.cn/p/5b6dfc954315
https://mp.weixin.qq.com/s/Gp1EJunbhcZ1x1V2augpSA
https://mp.weixin.qq.com/s/QVvfD9dIphRdE1RVkRpjdg
https://shengxin.ren/article/428
http://www.itdecent.cn/p/b4b43e467c33
http://www.itdecent.cn/p/b400dc7c5eea
