DNA 組裝（Assembly）

DNA Assembly是分子克隆（Molecular cloning，即核酸片段的in vivo增殖）中不可或缺的步驟。它將目標核酸序列引入微生物體的載體（Vector）中，通常充當vector的是細菌的質(zhì)粒

質(zhì)粒（Plasmid）

• 質(zhì)粒是除基因組之外的環(huán)狀DNA，是微生物的交流工具
• 易于儲存、提取和轉(zhuǎn)化，是基因工程的載體
• 大小在幾k到十幾k，最大達200k

細菌的染色體與質(zhì)粒

質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)

質(zhì)粒由三個部分組成：復制起始位點（Origin）、AB（抗生素）Resistance、多克隆位點（MCS）。其中 AB Resistance 用于表達抗生素抗性蛋白，用于篩選成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細菌。MCS用于組裝目標基因：商業(yè)化質(zhì)粒的MCS往往含有多種Restriction site且每個位點唯一

一個用于分子克隆的質(zhì)粒的典型結(jié)構(gòu)

DNA的連接（ligation）

DNA連接酶（ligase）可將缺口（nick，即斷裂的磷酸二酯鍵）修復連接。而裂口（gap，有堿基的缺失）則首先需要DNA Polymerase的活性，最后DNA ligase修補nick

DNA連接酶活性

DNA的限制性酶切（Ristricted Digestion）

• Ristricted指酶切具有特定的識別位點（Restriction Site）
• 末端：粘末端（可互補配對），分為5'粘末端與3'粘末端

酶切后不同的DNA末端

• 來源：細菌抵御來自噬菌體等的外源性DNA時會將其切斷。 a）若切割某一固定位點，為限制性內(nèi)切酶(ristricted endonuclease）（自身序列往往很少含有此類內(nèi)切酶的酶切位點，或即使含有，也受到甲基化保護，以防止自身DNA受到切割） b）若切割位點與給定外源DNA序列有關(guān)，則為CRISPER

標準化組裝

標準化組裝試圖解決MCS只能組裝一個DNA片段的缺陷。其方法有兩種

1. 每次組裝一個片段，可重復組裝（以Biobrick Assembly為代表）
2. 一次組裝多個片段（以Golden Gate為代表）

SLIC組裝

SLIC（Sequence and Ligation independent cloning）發(fā)明于2007年，是一種一次組裝多個片段的組裝方法。SLIC在目標片段上構(gòu)造overlap，并使得overlap形成互補的粘末端

SLIC組裝

• 首先設(shè)計PCR引物，使得DNA片段擁有相鄰片段的端部序列
• 利用T4 DNA Polymerase的3'端外切活性形成DNA片段的粘性末端。粘性部分的長度由反應(yīng)時間粗略控制
• 退火，粘末端互補，利用DNA Polymerase 和 DNA Ligase修補gap

缺點：無法應(yīng)用與較短片段的連接（3'端外切無法準確控制長度）。Polymerase補全gap時容易引入錯誤

Gibson組裝

Gibson組裝的基本思想與SLIC無異，也是一種利用overlap的拼接策略。其改進之處在于將外切、聚合、連接集中于一個反應(yīng)之中。

2010年，Venter實驗室發(fā)表了人造生命Synthia的合成，其第一作者Gibson以自己的名字命名并發(fā)表了這種DNA組裝方式。正是這種新穎的組裝方式幫助人類造出了第一例完全攜帶人造DNA的生命體

典型protocal的反應(yīng)溶液包括T5 exonuclease、Phusion polymerase與Taq ligase。5'外切酶首先將DNA片段的3'末端暴露，隨后粘末端互補，phusion聚合酶的聚合作用快于exonuclease的外切活性，最終追及形成nick，由Taq ligase補全

Gibson組裝

Golden Gate組裝

Golden Gate組裝是一種利用限制性內(nèi)切酶進行一次多個片段組裝的策略。它使用了一種與眾不同的限制性內(nèi)切酶——BsaI，其識別序列與酶切序列不在同一位置

BsaI的Restriction site

限制性內(nèi)切酶BsaI提供了這樣兩個特性：1.酶切后的粘末端可以人為設(shè)計 2.切口兩側(cè)僅有一側(cè)擁有酶切位點。利用前一個特性，可以指定多個片段相互連接的先后順序。利用后一個特性，可以保證在酶切活性的環(huán)境中，僅有正確連接的片段能保存完整，而錯誤連接的片段會再次被酶切

以兩個片段的Golden Gate組裝為例。Vector質(zhì)粒提供載體，而Target質(zhì)粒提供目標片段。將Vector的BsaI識別區(qū)域設(shè)計在內(nèi)內(nèi)側(cè)，而將Target的BsaI設(shè)別區(qū)域設(shè)計在外側(cè)（如圖）。如此僅有正確連接（Vector + Target）的質(zhì)粒不含有BsaI識別位點

Golden Gate組裝的Restriction site設(shè)計

將設(shè)計好的片段與BsaI、ligase混合在高溫（37℃）與低溫（16℃）之間迭代數(shù)次。高溫有利酶切而低溫有利連接，每次迭代會導致未連接或連接回原質(zhì)粒的片段再次遭到酶切，從而以更大的概率保留正確組裝的質(zhì)粒。最后以55℃加熱，有利于酶切且ligase失活，盡可能排除錯誤的組裝

Golden Gate組裝的典型protocal

BioBrick組裝

BioBrick是最早提出的DNA標準化組裝策略，是iGEM競賽中最常用的組裝策略。2004年由MIT提出

同尾酶（isocaudomer）指識別序列不同而酶切后粘末端相同的序列，如XbaI與SpeI。其粘末端在退火后互補，但互補后的片段不再含有酶切位點

BioBrick所使用的兩組酶切位點，其中XbaI與SpeI是為尾酶

利用一組同尾酶和另外兩個酶切位點（EcoRI、PstI），BioBrick實現(xiàn)了可重復的、順序性的DNA拼接。例如，將A片段拼接在B片段之前，則首先將A質(zhì)粒用E與S酶切，將B質(zhì)粒用E與X酶切。分別PCR擴增目標序列，隨后將二者混合，退火并連接即可。連接后的質(zhì)粒仍然帶有EX/SP前綴與后綴，因此仍是一個可以繼續(xù)連接組件的BioBrick元件

BioBrick組裝策略

BioBrick組裝會在序列之間留下一段8bp的疤痕（scar），導致ORF的移動，影響了融合蛋白（fusion protein）的表達。2008年提出的BB-2策略修改了酶切位點，使得Scar變?yōu)?bp

BB-2組裝策略

另一種改進策略將BioBrick的同尾酶替換為BgI II與BamH I。這對同尾酶產(chǎn)生的scar可被翻譯為短蛋白linker從而應(yīng)用于fusion protein

LCR（Ligase Cycling Reaction）組裝

LCR的思路與PCR有些相似。LCR是一種比較暴力的，基于耐熱ligase的DNA組裝方法，發(fā)明于2016年。同PCR一樣，LCR也要求首先一段單鏈“引物”，只不過在LCR中這段引物同時和兩段DNA片段互補，成為單鏈橋接寡核苷酸（single strand bridging oligo）。高溫下DNA變形后有一定幾率恰好同時與此LCR引物結(jié)合，退火后耐熱ligase修補缺口。經(jīng)過多個循環(huán)，大量的DNA片段在bridging oligos的引導下被ligase連接

LCR組裝

此方法可應(yīng)用于在長片段、多片段的連接中正確率相比傳統(tǒng)方法更高，但成功率一般