這次分享的是一篇中規(guī)中矩的文章，并沒有太多出彩的地方，但是邏輯性較好，對于試驗(yàn)方法的應(yīng)用具有較強(qiáng)的借鑒意義。福建農(nóng)林的老師于2019年發(fā)表在plant physiology上的paperA Magnaporthe Chitinase Interacts with a Rice
Jacalin-Related Lectin to Promote Host Colonization
Abstract
水稻稻瘟病的基因組編碼15個(gè)糖苷水解酶，18個(gè)家族的幾丁質(zhì)水解酶。本文主要講了稻瘟病中的chitinase MoChi1和水稻中的膜蛋白 OsMBL1互作，從而在植物PTI過程中發(fā)揮作用。在稻瘟病中敲除MoChi1還會導(dǎo)致菌絲減少和毒性減少，因?yàn)閷?dǎo)致了植物防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)。OsMBL1正調(diào)抗病性，MoChi1抑制了幾丁質(zhì)介導(dǎo)的活性氧爆發(fā)，并且與OsMBL1競爭性結(jié)合幾丁質(zhì)。
Results
1.MoChi1 Is a Highly Conserved Chitinase from M. oryzae
MoChi1包含N端信號肽和GH18(Glycoside hydrolase)結(jié)構(gòu)域，并且與其他致病真菌的糖苷水解酶同源性很高，暗示其可能有幾丁質(zhì)酶的活性。
2.MoChi1 Is an Extracellular Chitinase Released by
M. oryzae
構(gòu)建MoChi1連GFP的載體，做融合蛋白，轉(zhuǎn)入稻瘟病菌中，從上清中收集到了蛋白，說明MoChi1是個(gè)胞外蛋白。接下來使用yeast trap secretion assay 證明其分泌特征，與蔗糖酶(SUC2)構(gòu)建融合蛋白，一個(gè)是全長(FL-MoChi1)，一個(gè)去掉去掉信號肽但在蛋白前段加上‘ATG’(NS-MoChi1)。如果蔗糖酶分泌的話，就會把蔗糖水解成葡萄糖和果糖。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)FL-MoChi1的酵母在蔗糖培養(yǎng)基上生長且培養(yǎng)基變紅，而NS-MoChi1在蔗糖培養(yǎng)基中不生長，說明MoChi1中信號肽對其分泌很重要。
使用幾丁質(zhì)結(jié)合和幾丁質(zhì)分解活性的試驗(yàn)來檢測MoChi1是否有幾丁質(zhì)酶活性。在幾丁質(zhì)結(jié)合試驗(yàn)中，將純化的SSB-MoChi1-6*His蛋白與不溶性的細(xì)胞壁多糖孵育，結(jié)果顯示，融合蛋白特異性地與不溶性的幾丁質(zhì)beads、crab shell chitin、chitosan、稻瘟病的細(xì)胞壁和幾丁質(zhì)共沉淀，而不與纖維素共沉淀。這些結(jié)果揭示MoChi1特異性結(jié)合幾丁質(zhì)。
MUC3是幾丁質(zhì)酶的一種商業(yè)化的熒光底物，使用它來查看幾丁質(zhì)酶的活性。
綜上，這些結(jié)果顯示，MoChi1是一種由稻瘟病分泌的幾丁質(zhì)酶，能將MUC3降解成短鏈。
3.MoChi1 Is Involved in M. oryzae Aerial Growth
首先檢查MoChi1在稻瘟病不同時(shí)期的亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)大部分MoChi1在營養(yǎng)菌絲隔膜上積累。以菌落直徑作為衡量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，在稻瘟病中敲除MoChi1并不會造成營養(yǎng)生長的缺陷。
4.MoChi1 Is Required for the Aggressiveness of M. oryzae
為了確定MoChi1是否促進(jìn)了稻瘟病的致病性，將Ku80(WT)、ΔMochi1(KO), and ΔMochi1/MoChi1(complement)接種于感病植株(CO39)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ΔMochi1菌的數(shù)量和大小比WT和互補(bǔ)菌中更少。通過對稻瘟病轉(zhuǎn)座因子基因Pot2的定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)ΔMochi1的生物量比野生型Ku80和互補(bǔ)菌株ΔMochi1/MoChi1減少了4- 5倍的生物量。
5.MoChi1 Interacts with the Rice JRL OsMBL1
酵母曬庫篩到OsMBL1，通過Y2H，Co-IP，BiFC(揭示其互作可能發(fā)生在膜上)，PULL DOWN驗(yàn)證了其互作。缺乏N端19個(gè)氨基酸的OsMBL1仍能與MoChi1互作；而缺乏C端66個(gè)氨基酸的OsMBL1不能與MoChi1互作，N端和C端同時(shí)切掉后，也沒有互作，這就揭示了OsMBL1的C端對于其與MoChi1的互作很重要。
6.OsMBL1 Is Responsive to PAMPs and M. oryzae Infection
chitin處理2h后，OsMBL1的表達(dá)量上升了大約六倍；flg22處理后，在30min到2h之間，表達(dá)量上升2-5倍不等。而接種稻瘟病后，在24h后大約上升了15倍。
7.Overexpression of OsMBL1 Enhances Rice Resistance to
M. oryzae
OsMBL1過表達(dá)植株中展示出十倍減少的真菌定植量。為了尋找OsMBL1在PTI中的作用，我們衡量了OsMBL1中ROS的爆發(fā)，然后發(fā)現(xiàn)在OsMBL1過表達(dá)植株中幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的ROS的積累出現(xiàn)更早且強(qiáng)。將OsMBL1 RNAi后，在日本晴背景中，病斑長度更大。
8.MoChi1 Competes with OsMBL1 for Chitin Binding and
Suppresses Chitin-Induced ROS in Rice Cells
植物病原菌釋放的低聚糖可以被宿主PRR識別，從而啟動防御反應(yīng)。預(yù)測糖基磷脂酰肌醇位點(diǎn)錨定在OsMBL1C端，提示該蛋白可能與質(zhì)膜相聯(lián)系。煙草瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)轉(zhuǎn)材料都揭示OsMBL1在質(zhì)膜上。
為了查明OsMBL1是否結(jié)合幾丁質(zhì)，純化的GST-OsMBL1與不同的多糖進(jìn)行孵育。結(jié)果顯示，OsMBL1與不溶性的幾丁質(zhì)beads、crab shell chitin、chitosan、來自稻瘟病的細(xì)胞壁成分、來自稻瘟病的chitin和纖維素都有共沉淀，這就揭示了OsMBL1能夠結(jié)合稻瘟病的細(xì)胞壁、幾丁質(zhì)和纖維素。
稻瘟病中的LysM效應(yīng)子 Slp1競爭性抑制幾丁質(zhì)受體CEBiP，并且抑制了幾丁質(zhì)觸發(fā)的免疫反應(yīng)。往GST-OsMBL1溶液中滴定SSB-MoChi1-6XHis，然后再加入chitin beads。我們觀察到添加的MoChi1的量與用幾丁質(zhì)珠拉下的OsMBL1的量呈負(fù)相關(guān)(隨著SSB-MoChi1-6XHis濃度的增加，PULL DOWN下來的OsMBL1量減少，而MoChi1的量變多；反過來也發(fā)現(xiàn)隨著OsMBL1的量增加，MoChi1的量也減少)。這些結(jié)果說明，MoChi1與OsMBL1競爭性的結(jié)合chitin。體內(nèi)試驗(yàn)的話，就用ROS burst作為marker，用純化的蛋白來孵育。
最后是model圖。
