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CRISPR-CAS9技術(shù)的火熱和應(yīng)用前景無(wú)需多提，為了了解這個(gè)領(lǐng)域，我們梳理了下CRISPR的發(fā)展歷程，做個(gè)學(xué)習(xí)和記錄。有疏漏和不足之處，還請(qǐng)指正。

1987: 大腸桿菌中報(bào)道CRISPR重復(fù)序列 (當(dāng)時(shí)還不叫CRISPR)。這是長(zhǎng)29 bp，間隔32 bp的5個(gè)高度同源的序列組成。當(dāng)時(shí)其它原核生物中未找到同源序列，重要性未知。(日本¹)

2002: CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)術(shù)語(yǔ)用于描述細(xì)菌和古細(xì)菌中長(zhǎng)度在21 ~ 37 bp，中間間隔相等大小非重復(fù)序列的重復(fù)序列簇。4個(gè)CRISPR相關(guān)的基因 (cas基因)因位于CRISPR位點(diǎn)臨近而鑒定出來(lái)并因此命名，表明這兩者之間存在功能關(guān)系。類(lèi)似我們?cè)?a target="_blank" rel="nofollow">用STRING尋找蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中提到基于基因組位置的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)的cas4基因有RecB核酸外切功能域。 (荷蘭 ²)

2005: CRISPR間隔序列發(fā)現(xiàn)與外源DNA匹配。CRISP在更多原核基因組發(fā)現(xiàn)，cas家族蛋白鑒定出7個(gè)。間隔序列發(fā)現(xiàn)與其它基因尤其是來(lái)自于噬菌體和其它染色體外元件的序列同源。S. thermophilus (嗜熱鏈球菌)對(duì)噬菌體的敏感性與CRISPR位點(diǎn)出間隔序列的多少有關(guān)。作者認(rèn)為間隔序列是對(duì)染色體外元件侵染的記錄，通過(guò)編碼反義RNA提供對(duì)噬菌體或外源DNA侵染的細(xì)胞免疫。(法國(guó)³)

2006: CRISPR首次提出可以作為細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。Koonin EV等把cas基因根據(jù)蛋白序列歸類(lèi)為25個(gè)不同的家族。比較基因組學(xué)分析把CRISP-Cas系統(tǒng) (CAAS)對(duì)抗入侵的噬菌體和質(zhì)粒類(lèi)比與真核生物中的RNA干擾。雖然序列相差較大，但兩個(gè)系統(tǒng)的同工酶有很好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。但作者認(rèn)為這一系統(tǒng)在進(jìn)化上是不穩(wěn)定的，因?yàn)榧捌湎嘟脑松镏苯有蛄卸枷嗖钶^大。(美國(guó)⁴)

2007: 比2005年的研究再進(jìn)一步，證實(shí)了其推論。發(fā)現(xiàn)病毒侵染后細(xì)菌整合來(lái)自于噬菌體基因組的序列作為新的間隔序列。移除或增加特殊的間隔序列改變了細(xì)菌的噬菌體抗性。(美國(guó)⁵)

2009: CRISPR RNA-cas切割入侵RNA首次報(bào)導(dǎo)。該實(shí)驗(yàn)室還發(fā)現(xiàn)新進(jìn)加入的間隔序列在細(xì)菌中轉(zhuǎn)錄豐度最高。(美國(guó)⁶)

2010: 與2007年的結(jié)論無(wú)異。(加拿大⁷)

2011: repeat/spacer來(lái)源的crRNA的前體重復(fù)序列互補(bǔ)的24-nt反式tracrRNA促進(jìn)crRNA的成熟和發(fā)揮作用，對(duì)抗入侵者。 (瑞典⁸)

2012: 發(fā)現(xiàn)Cas9可以在crRNA與靶DNA互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合的條件下作為內(nèi)切酶誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，提出RNA控制的基因組編輯。HNH功能域切割互補(bǔ)鏈，RuvC-樣功能域切割非互補(bǔ)鏈。(美國(guó)⁹)

2013: 短RNA介導(dǎo)CRISPR/Cas9用于編輯人和小鼠細(xì)胞的基因。(美國(guó)¹⁰，華人張鋒)。同年，CRISPR/Cas9應(yīng)用于植物基因編輯。(美國(guó)¹¹，英國(guó)¹²)

2014: Cas9與guide RNA和target DNA復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。5'-NGG-3' protospacer adjacent motif (PAM) 依賴(lài)的靶DNA的解鏈和RNA-DNA復(fù)合體的形成。(日本¹³，瑞士¹⁴)。

2015: 在人三原核合子(移植前胚胎)中，應(yīng)用CRISPR/Cas9有效編輯內(nèi)源性beta-globin基因，并且發(fā)現(xiàn)脫靶現(xiàn)象。(中國(guó)¹⁵)

2016: CRISPR/Cas9編輯的作物不被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因作物，一是缺少外源DNA，二是不好區(qū)分。(Nature news¹⁶)

2016: NIH批準(zhǔn)第一個(gè)CRISPR基因編輯臨床試驗(yàn)，編輯T細(xì)胞治療癌癥。(Nature news¹⁷)

2017: 哺乳動(dòng)物中CRISPR/Cas13編輯RNA (美國(guó)¹⁸)和不需要DNA切割的高敏感低脫靶腺嘌呤堿基編輯器 (adenine base editors, ABEs) (美國(guó)¹⁹)。這兩個(gè)都是華人的工作，第二篇的作者David Liu入選2017年Nature十大人物。

2018: 人血清中發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白抗體。最常用Cas9同源蛋白來(lái)自于金黃色葡萄球菌和化膿鏈球菌。這兩種菌在人群中有較高的感染頻率，79%的捐贈(zèng)人和65%的捐贈(zèng)人有金黃色葡萄球菌和化膿鏈球菌的抗體。 (美國(guó)²⁰)

https://timelines.issarice.com/wiki/Timeline_of_CRISPR

這只是比較粗淺的總結(jié)，還有很多重要的研究沒(méi)有囊入。比如CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因激活、染色體修飾的改變等。

更多關(guān)于CRISPR/CAS9的總結(jié)和發(fā)展趨勢(shì)還需要那些活躍在一線(xiàn)，真真正正做技術(shù)的牛人們來(lái)解答。但牛人太忙，偶爾見(jiàn)一面，也只是找我們尋求服務(wù)?，F(xiàn)在有了一個(gè)他們向大家作報(bào)告的機(jī)會(huì)。

應(yīng)廣大參會(huì)嘉賓的強(qiáng)烈呼吁，基因編輯學(xué)術(shù)研討會(huì)組委會(huì)邀請(qǐng)來(lái)自基因編輯領(lǐng)域的教授、學(xué)者及科研技術(shù)工作者 (下圖嘉賓)齊聚一堂，于2018年3月30日-31日在北京維也納國(guó)際酒店(北京廣安門(mén)店)通過(guò)思想的切磋與碰撞，共議基因編輯發(fā)展趨勢(shì)、創(chuàng)新前沿技術(shù)等熱點(diǎn)話(huà)題。通過(guò)組委會(huì)精心安排的主題演講、專(zhuān)家頭腦風(fēng)暴等豐富多彩的大會(huì)形式和內(nèi)容，為大家提供最前沿的技術(shù)資訊、科研發(fā)展趨勢(shì)和最新動(dòng)向及廣泛的交流與合作機(jī)會(huì)。