【單細胞轉(zhuǎn)錄組】TooManyCells識別并可視化單細胞進化枝

簡介：

簡單說，就是如果覺得目前的聚類軟件的分類效果不太好，可以用這個軟件用可視化進化分支的形式將細胞分群

詳細教程

安裝

由于不想安裝那么多的依賴包，下面的操作全部基于Docker

docker pull gregoryschwartz/too-many-cells:0.2.2.0

啟動docker容器

docker run -it --rm -v "/home/luohb:/share/nas1/Data/Users/luohb/Personalization/20191206/TooManyCells" gregoryschwartz/too-many-cells:0.2.2.0 -h
too-many-cells, Gregory W. Schwartz. Clusters and analyzes single cell data.

Usage: too-many-cells (make-tree | interactive | differential | diversity |
                      paths)

Available options:
  -h,--help                Show this help text

Available commands:
  make-tree                
  interactive              
  differential             
  diversity                
  paths

輸入文件構建

這里輸入既可以是一個文件夾（里面放 10X cellranger 的 3 個文件），也可以是一個 csv 格式的普通表達矩陣

1. 矩陣：

PS:如果是一個count矩陣文件記得第一行的第一列是逗號，行名標簽和列標簽可以沒有雙引號

"","A22.D042044.3_9_M.1.1","C5.D042044.3_9_M.1.1","D10.D042044.3_9_M.1.1","E13.D042044.3_9_M.1.1","F19.D042044.3_9_M.1.1","H2.D042044.3_9_M.1.1","I9.D042044.3_9_M.1.1",...
"0610005C13Rik",0,0,0,0,0,0,0,...
"0610007C21Rik",0,112,185,54,0,96,42,...
"0610007L01Rik",0,0,0,0,0,153,170,...
"0610007N19Rik",0,0,0,0,0,0,0,...
"0610007P08Rik",0,0,0,0,0,19,0,...
"0610007P14Rik",0,58,0,0,255,60,0,...
"0610007P22Rik",0,0,0,0,0,65,0,...
"0610008F07Rik",0,0,0,0,0,0,0,...
"0610009B14Rik",0,0,0,0,0,0,0,...
...

2. 標簽文件

item,label
AAACCTGCAGTAACGG-1,Marrow
AAACGGGAGACCGGAT-1,Marrow
AAACGGGAGCGCTCCA-1,Marrow
AAACGGGAGGACGAAA-1,Marrow
AAACGGGAGGTACTCT-1,Marrow
...

這里的標簽文件，可以是細胞的樣本來源信息，或者認為分群的標簽，只作為最后上色的結(jié)果，不影響最后進化樹的分支結(jié)構

運行

docker run -it --rm -v /share/nas1/Data/Users/luohb/Personalization/TooManyCells/test:/test \
      gregoryschwartz/too-many-cells:0.2.2.0 make-tree \
      --matrix-path /test/count.csv \
      --labels-file /test/OrigIdent.labels.csv \
      --draw-collection "PieRing" \
      --output /test/LabelsBySamples > log

結(jié)果類似這樣


“修剪”分支

默認參數(shù)下的分支太細了，可以通過兩種方式來調(diào)整：

  • 直接設置 --min-size :規(guī)定最小分支細胞數(shù)。使用參數(shù)將葉子的最小大小設置為100個細胞
  • 設置 --smart-cutoff ，通過 n*中位數(shù)絕對偏差（MAD） ，改變樹上葉子的數(shù)量。
    可以結(jié)合--min-size，--max-proportion， --min-distance，或--min-distance-search一起用

另外，我們不需要重新計算整個樹！我們可以使用參數(shù)--prior來提供以前的結(jié)果（我們也可以用--prior刪除--matrix-path 來加快處理速度，不過可能會失去某些功能特性）

docker run -it --rm -v /share/nas1/Data/Users/luohb/Personalization/TooManyCells/test:/test \
      gregoryschwartz/too-many-cells:0.2.2.0  make-tree \
      --prior /test/LabelsBySamples --labels-file /test/OrigIdent.labels.csv \
      --smart-cutoff 1 --min-size 1 \
      --draw-collection "PieChart"   #末端改成餅圖 \
      --output /test/pruned_LabelsBySamples > log1_2

最后結(jié)果類似


提取子集

cp log3_2 clusters_pruned.csv
vi clusters_pruned.csv
# vim中
%s/^M$//g

各個節(jié)點的結(jié)果在Docker中會顯示有些問題，需要手動修改成以下形式

$ head clusters_pruned.csv
cell,cluster,path
AAACGGGAGGTGTTAA.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
AACACGTTCGGCGGTT.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
AACCGCGGTATATGAG.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
ACACCCTTCTGGTTCC.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
ACCTTTAAGGTGTTAA.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
ACGAGGACACGTTGGC.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
AGGGAGTCAGGCTCAC.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
AGGGATGAGCGATAGC.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0
AGTGGGAAGATGTAAC.1,9,9/8/7/6/5/4/3/2/1/0

標注上節(jié)點信息

docker run -it --rm -v /share/nas1/Data/Users/luohb/Personalization/TooManyCells/test:/test \
    gregoryschwartz/too-many-cells:0.2.2.0 make-tree 
    --prior /test/LabelsBySplitGroup \
    --labels-file /test/SplitGroup.labels.csv --smart-cutoff 1 --min-size 1 --draw-collection "PieChart" \
    --draw-node-number  #加上節(jié)點信息\
    --output /test/number_pruned_LabelsBySplitGroup > log7

然后可以根據(jù)節(jié)點對應的barcode去提取細胞子集

基因表達情況

docker run -it --rm -v /share/nas1/Data/Users/luohb/Personalization/TooManyCells/test:/test \
    gregoryschwartz/too-many-cells:0.2.2.0 make-tree \
    --prior /test/LabelsBySplitGroup \
    --matrix-path /test/count.csv \
    --labels-file /test/SplitGroup.labels.csv  \
    --smart-cutoff 1 \
    --min-size 1 \
    --draw-leaf "DrawItem (DrawThresholdContinuous [(\"gene1\", 0), (\"gene2\", 0)])" \
    --draw-colors "[\"#e41a1c\", \"#377eb8\", \"#4daf4a\", \"#eaeaea\"]"\
    --draw-scale-saturation 10 \
    --output /test/out_gene_expression \
    > clusters_pruned_gene_expression.csv

結(jié)果類似


差異基因分析

根據(jù)提供的標簽進行差異基因分析

兩個節(jié)點之間的差異分析

$docker run -it --rm -v /share/nas1/Data/Users/luohb/TooManyCells/test:/test \
    gregoryschwartz/too-many-cells:0.2.2.0 differential \
    --prior /test/LabelsBySplitGroup \
    --matrix-path /test/count.csv \
    --labels-file /test/SplitGroup.labels.csv  \
    -n "([70, 3, 105, 166], [45])" \
    > clusters_pruned_gene_expression.csv

對所有節(jié)點進行查找Marker基因

$cat run12.sh 
$docker run -it --rm -v /share/nas1/Data/Users/luohb/TooManyCells/test:/test \
    gregoryschwartz/too-many-cells:0.2.2.0 differential \
    --prior /test/LabelsBySplitGroup \
    --matrix-path /test/count.csv \
    -n "([], [])" \
    --normalization "UQNorm" \
    +RTS -N26
    --plot-output /test/plot.pdf
    -t 5  #限定節(jié)點層級

$sh run12.sh >FindAllMarker.txt
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