在高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的處理中（例如，在重測(cè)序研究、組裝結(jié)果的re-mapping校正中），我們經(jīng)常會(huì)將測(cè)序reads與參考序列進(jìn)行比對(duì)（常見(jiàn)的如BWA、Bowtie等工具），并將比對(duì)結(jié)果以bam文件存儲(chǔ)（sam文件的二進(jìn)制格式，極大節(jié)省了存儲(chǔ)空間。對(duì)于bam/sam文件的簡(jiǎn)介說(shuō)明，點(diǎn)擊查看）。在linux系統(tǒng)下，通常我們可以很方便的使用samtools對(duì)參考序列以及bam文件進(jìn)行處理。
雖然大多數(shù)情況下bam文件僅作為數(shù)據(jù)存儲(chǔ)文件使用，但有時(shí)候我們還是很期望將bam文件中的內(nèi)容可視化，例如查看測(cè)序reads在參考基因組序列中的對(duì)齊分布、覆蓋程度等?？赡苓@時(shí)候，常用的bam文件處理工具samtools就不太容易滿足需求（盡管samtools也能實(shí)現(xiàn)這種可視化功能，但是可視化效果比較簡(jiǎn)陋，在終端界面下僅有簡(jiǎn)單的點(diǎn)和線構(gòu)成）。對(duì)于其它的工具，我們也有很多可以選擇，例如IGV、Tablet等，將參考序列fasta文件以及比對(duì)結(jié)果bam文件導(dǎo)入后即可將參考序列的堿基組成信息、測(cè)序reads在參考序列中的位置以及覆蓋情況等可視化呈現(xiàn)。本文簡(jiǎn)介如何使用Tablet查看bam文件。
本文使用到的示例bam文件，以及參考基因組序列，可在以下鏈接獲取。
https://pan.baidu.com/s/1yYQNxty5hBdcpoA8xkrQUg
其中，bam文件“Bacillus_subtilis.dup.bam”及其索引文件“Bacillus_subtilis.dup.bam.bai”（由samtools建立索引獲得）可見(jiàn)“B-rmdup”；參考基因組序列“Bacillus_subtilis.str168.fasta”可見(jiàn)“0-refer”。
Tablet下載安裝
其實(shí)一直很疑惑，Tablet這個(gè)軟件很早就有了，而且用起來(lái)感覺(jué)還不錯(cuò)，就是不知為啥網(wǎng)上很少能搜到它的相關(guān)介紹。看看IGV，教程那么多……雖然IGV功能更多，但是Tablet作為一款好用的輕量級(jí)軟件，應(yīng)該使用率也很廣才對(duì)。
多余的話就先不說(shuō)了，Tablet官方網(wǎng)站：https://ics.hutton.ac.uk/tablet/
點(diǎn)擊“download”即可進(jìn)入下載界面，下載界面提供了3種平臺(tái)的版本，根據(jù)需要選擇對(duì)應(yīng)的版本下載。Tablet源碼可見(jiàn)https://github.com/cropgeeks/tablet。
作為一款優(yōu)秀的高通量測(cè)序序列查看器，除了能夠查看序列比對(duì)結(jié)果bam/sam文件外，Tablet還有很多功能。本文中不再細(xì)說(shuō)其它功能，可見(jiàn)官網(wǎng)上其功能描述，或者點(diǎn)擊原參考文獻(xiàn)閱讀，以及參閱幫助文檔（http://tablet.hutton.ac.uk/en/latest/index.html）等，詳細(xì)了解該軟件的使用。
Tablet使用起來(lái)挺簡(jiǎn)單的，對(duì)于常規(guī)的功能（例如查看bam/sam文件等），無(wú)需參閱幫助文檔也能夠快速上手。在這里我下載了windows版的，并在下文簡(jiǎn)要展示其使用。
使用Tablet查看BAM文件
數(shù)據(jù)導(dǎo)入
bam文件在Tablet中的可視化需要用到索引文件bam.bai。使用samtools軟件獲得bam文件的索引文件bam.bai，以示例文件為例，在linux命令行下使用“samtools index Bacillus_subtilis.dup.bam”，即可得到“Bacillus_subtilis.dup.bam.bai”。
導(dǎo)入文件至Tablet時(shí)，必須保證“Bacillus_subtilis.dup.bam”與“Bacillus_subtilis.dup.bam.bai”在同一路徑中才能夠?qū)am文件成功導(dǎo)入。
fasta文件中的序列，必須和bam文件中的序列信息相互對(duì)應(yīng)。
Tablet界面基本操作介紹
等待一小會(huì)兒后，數(shù)據(jù)成功導(dǎo)入。若fasta文件中存在多條序列，則在界面左側(cè)會(huì)顯示多條序列id，點(diǎn)擊對(duì)應(yīng)的序列id即可查看測(cè)序reads在參考序列上的分布情況。在主界面中，測(cè)序reads在該序列上的對(duì)齊位置、覆蓋程度、堿基差異等信息清晰可見(jiàn)。
備注：右鍵“新標(biāo)簽打開(kāi)圖片”等操作可以查看大圖。
默認(rèn)情況下，測(cè)序reads以A、T、G、C等堿基類型著色。在界面上方點(diǎn)擊“Colour Schemes”，可更改reads顏色展示方式。例如點(diǎn)擊“Variants”后，reads序列中與參考序列一致的堿基將展示為灰色，不一致的展示為紅色（變異堿基，或者測(cè)序錯(cuò)誤導(dǎo)致等）。
在“Advanced”中，可更改界面風(fēng)格、窗口展示等。例如，點(diǎn)擊?“Coverage”?選項(xiàng)后，在序列整體reads覆蓋情況窗口界面中，將會(huì)以漸變色的的樣式來(lái)展示reads在參考序列中的覆蓋深度情況（參見(jiàn)上文，之前的樣式是以A、T、G、C四種顏色展示的，即“Scaled”選項(xiàng)）。
常用的過(guò)濾/查找/定位選項(xiàng)
以上是對(duì)Tablet主界面的基本簡(jiǎn)介，其實(shí)該軟件上手挺簡(jiǎn)單的。在了解了它的基本情況后，我們來(lái)看一些常用的過(guò)濾/查找/定位選項(xiàng)，以幫助我們定位、查找想要得知的信息。
若想快速定位至參考序列的某一段區(qū)域，可在“Advanced”中點(diǎn)擊“Subset”選擇查看的區(qū)域。
若想將參考序列中某一段序列截?。◤?fù)制）下來(lái)，需要在主界面的參考序列展示位置處右擊，選擇“Copy a subsequence to clipboard”后，在彈出的窗口中輸入選定的序列區(qū)域，再點(diǎn)擊“Copy”即可完成復(fù)制。此時(shí)可以任意打開(kāi)一個(gè)文本編輯器（如記事本），ctrl+v粘貼即可。
若想查找某一條測(cè)序reads在參考序列中的對(duì)齊位置，在界面左方點(diǎn)擊搜索框，選擇搜索類型后輸入reads的id即可。
在左側(cè)窗口中點(diǎn)擊“more”，可以查看參考序列的基本統(tǒng)計(jì)信息，包含fasta文件中序列的平均長(zhǎng)度、最長(zhǎng)/最短序列等。在多條參考序列的情況下，想過(guò)濾一些不必要的序列時(shí)，可以在這里操作。
其它信息
在主界面查看序列reads覆蓋情況時(shí)，有時(shí)會(huì)看到這樣的標(biāo)記“[”、“]”等。
備注：當(dāng)標(biāo)記不為單一的“[”等組成，而是由一連串連續(xù)的標(biāo)記組成時(shí)，需仔細(xì)查看參考序列的這段位置與測(cè)序reads之間是否存在著較大的差異。在重測(cè)序中，通常表明兩個(gè)個(gè)體基因組中，在這段區(qū)域的序列組成具有明顯的區(qū)別。若參考序列為使用相同的測(cè)序reads數(shù)據(jù)組裝所得的序列時(shí)，則需要著重檢查該區(qū)域是否出現(xiàn)了錯(cuò)誤拼接。如下示例，參考序列為一段由測(cè)序reads組裝所得的序列，將測(cè)序reads重新比對(duì)至組裝結(jié)果中時(shí)，發(fā)現(xiàn)這段區(qū)域“]?”、“[”左右兩側(cè)的大多數(shù)reads幾乎沒(méi)有明顯的overlap區(qū)，幾乎全部被隔斷在左右兩側(cè)。似乎這段序列在這個(gè)位置不應(yīng)該被連在一起，更應(yīng)該被打斷為兩段序列才更合適。這時(shí)需要仔細(xì)檢查這段區(qū)域，是否存在少數(shù)reads能夠跨越這個(gè)交點(diǎn)，有效支持左右的序列連接；或者這里確實(shí)出現(xiàn)了錯(cuò)誤拼接，需要打斷處理。
參考序列中出現(xiàn)了一段區(qū)域無(wú)測(cè)序reads覆蓋的情況，如上文所說(shuō)。若有充分理由相信這不是測(cè)序未覆蓋到的情況時(shí)，則可以認(rèn)為測(cè)序個(gè)體的基因組中在該區(qū)域發(fā)生了較大的片段缺失。
對(duì)于小的堿基變異，如SNP、InDel等，也可通過(guò)比對(duì)結(jié)果清晰看出。如下示例，判斷SNP堿基以及測(cè)序錯(cuò)誤的堿基。
備注：如果有SNP、InDel檢測(cè)結(jié)果的vcf文件，則可以結(jié)合vcf文件中提供的變異位置信息，再通過(guò)Tablet查看比對(duì)結(jié)果，以更好地查看確認(rèn)這些位置。
此外，有時(shí)在Tablet中還會(huì)看到這樣的reads，展示的長(zhǎng)度很短。實(shí)際上，可能并非由于reads本身測(cè)得短，而是由于該reads中只有一部分能比對(duì)至參考序列的這段區(qū)域，未比對(duì)上的部分由于太長(zhǎng)就隱藏掉了。這種情形一般出現(xiàn)在重復(fù)序列中，如下所示（模糊的話，可右鍵“新標(biāo)簽頁(yè)打開(kāi)圖片”查看大圖）。
參考文獻(xiàn)：Milne I , Stephen G , Bayer M , et al. Using Tablet for visual exploration of second-generation sequencing data. Briefings in Bioinformatics, 2013, 14(2):193-202.
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