6xHis標(biāo)簽簡介

6xHis標(biāo)簽，也稱為多組氨酸標(biāo)簽（polyhistidine ），His6標(biāo)簽或hexa組氨酸標(biāo)簽，這是一種在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中目標(biāo)蛋白的C端或N端上由至少6個(gè)組氨酸殘基鏈接上所組成的氨基酸序列，它的序列如下所示：

堿基序列：
    CATCATCATCATCATCAT
    或
    CACCACCACCACCACCAC

氨基酸序列：
    HHHHHH

6xHis標(biāo)簽的優(yōu)點(diǎn)

相對小的分子量，低的免疫原性，親水性和在去污劑和其他添加劑存在的情況下的易變性，因此在天然和變性的條件下，多組氨酸標(biāo)簽是被公認(rèn)為最廣泛使用的親和標(biāo)簽用于一系列的蛋白純化目的。

可以檢測和純化重組蛋白而無需使用蛋白特異性的抗體或探針，同時(shí)抗His標(biāo)簽抗體的存在用于His標(biāo)簽蛋白的檢測中使6xHis標(biāo)簽更加的普遍和受歡迎。

His標(biāo)簽的用途

1. 親和純化蛋白

6xHis標(biāo)簽通常在重組蛋白的純化中使用，這是因?yàn)榻M氨酸殘基的序列可以在特定的緩沖液條件下結(jié)合到幾種類型固定的離子上（比如鎳，鈷和銅），從而達(dá)到容易檢測和純化His標(biāo)簽蛋白的目的。例如在大腸桿菌和其他原核系統(tǒng)中表達(dá)的多組氨酸標(biāo)簽重組蛋白通常使用固定的金屬離子親和色譜來純化或稱為IMAC，IMAC的全稱是 immobilized metal-affinity chromatography，即固定金屬親和層析。

親和的意思就是指采用抗原-抗體之間的特異性結(jié)合來分離出自己的目標(biāo)抗原或抗體。

IAMC一種非常有效的分離技術(shù)，它利用組氨酸能夠與金屬離子發(fā)生親和作用的原理對蛋白質(zhì)加以分離。例如伯樂的Profinity IMAC 介質(zhì)以UNOsphere? 為基質(zhì)，含有作為二價(jià)、三價(jià)金屬離子螯合配位體的亞氨基二乙酸 ( IDA )。當(dāng)配位體結(jié)合有 Zn2+、Ni2+ 或 Cu2+ 等金屬離子時(shí)，含組氨酸的蛋白會(huì)與此層析介質(zhì)結(jié)合。

在親和層析過程中，支撐物(通常是珠狀瓊脂糖凝膠或磁珠顆粒)用合適的耦合試劑來進(jìn)行衍生，比如氨三乙酸nitrilotriaceticacid(NTA)或亞氨乙酸iminodiaceticacid(IDA)。這些螯合的基團(tuán)會(huì)固定所需要的二價(jià)金屬離子(比如鎳，銅，鈷和鋅)，從而這些金屬離子最后負(fù)責(zé)結(jié)合和分離混合液蛋白中的目標(biāo)分子。在選擇使用哪個(gè)配基上，你需要考慮IMAC樹脂的結(jié)合能力主要取決于被純化蛋白的性質(zhì)和在純化過程中所使用的金屬離子。

鎳，鈷，銅是進(jìn)行純化His標(biāo)簽蛋白首選的被廣泛使用的離子，由于它們在水溶液中對于組氨酸和半胱氨酸良好的親和性。在這三個(gè)離子中，鎳是最廣泛使用的金屬離子，它呈現(xiàn)出最高的親和性和選擇性對于His標(biāo)簽蛋白.然而，它也會(huì)非特異性的結(jié)合包含組氨酸群的內(nèi)源蛋白。而鈷提供最特異性的結(jié)合和組氨酸標(biāo)簽因此當(dāng)純度是首要選擇時(shí)鈷是二價(jià)陽離子的首選。銅離子和鎳鈷離子相比和His標(biāo)簽蛋白的結(jié)合非常強(qiáng)勁，但是它的特異性在三種離子中是最弱的。由于這個(gè)原因，當(dāng)純度不是最主要的目的時(shí)銅離子IMAC被使用。

在制備樣品時(shí)，細(xì)胞被捕獲和裂解通過酶法或機(jī)械條件。因?yàn)槎嘟M氨酸標(biāo)簽在生理PH值和離子強(qiáng)度下很好的結(jié)合到IMAC樹脂上。結(jié)合在幾乎中性緩沖液的條件下完成。大部分科研人員使用包含10-25mM咪唑的TBS溶液作為結(jié)合/漂洗緩沖液來防止帶有組氨酸殘基內(nèi)源蛋白的非特異性的結(jié)合.被捕獲的組氨酸標(biāo)簽蛋白的洗脫和回復(fù)通常使用增加的咪唑濃度(至少200mM)來實(shí)現(xiàn)，低PH值或一個(gè)過量的強(qiáng)螯合劑比如EDTA。

2. 檢測目標(biāo)蛋白

ELISA或免疫印跡檢測：可以使用鎳螯合的辣根過氧化物酶來進(jìn)行基于HRP組氨酸標(biāo)簽蛋白的檢測而無需使用抗體。同時(shí)，抗6xHis的抗體是高度靈敏和特異性的對于那些含有組氨酸標(biāo)簽的蛋白。

凝膠染色：幾種免疫分析方法利用多組氨酸標(biāo)簽通過抗多組氨酸標(biāo)簽抗體或通過SDS-PAGE來檢測靶蛋白。

3. 蛋白相互作用

蛋白相互作用pull-down：鎳瓊脂糖樹脂可以用于純化，鑒定和檢測組氨酸標(biāo)簽蛋白的相互作用。

文獻(xiàn)解讀

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上面的圖片來源于2016年發(fā)表在《Immunity》上的Analysis of the Rab GTPase Interactome in Dendritic Cells Reveals Anti-microbial Functions of the Rab32 Complex in Bacterial Containment，文獻(xiàn)中就采用了6xHis標(biāo)簽來純化Rab蛋白，只是文獻(xiàn)中為了提高蛋白相互作用的可信度，提高蛋白的純化效果，采用的是2個(gè)標(biāo)簽的純化方法。

從(a)圖中可以看到FUYW-exact-6His-Rab字樣，這說明在Rab分子的N端加上了一個(gè)6xHis標(biāo)簽與eXact標(biāo)簽，eXact標(biāo)簽是一個(gè)能夠自割切的枯草桿菌結(jié)構(gòu)蛋白。在(b)圖中我們可以繼續(xù)看到，6xHis與Rab分子之間還加上了一個(gè)EYFP標(biāo)簽，這主要是為了方便構(gòu)建慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞時(shí)篩選，因此文獻(xiàn)中還提到了使用空的EYFP質(zhì)粒來做了陰性對照。

文獻(xiàn)中做蛋白相互作用的大致流程如下所示（其實(shí)圖(b)就是純化蛋白的過程）：

1. 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的eXact-6xHis-EYFP-Rab整合蛋白的DC2.4細(xì)胞；
2. 通過eXact-6xHis兩個(gè)標(biāo)簽進(jìn)行親和純化，其中eXact這個(gè)標(biāo)簽的特征在于它無需抗體進(jìn)行純化，因此就會(huì)降低引入高濃度外源抗體對質(zhì)譜分析的影響，當(dāng)溶液中的N3-離子濃度升高后，就會(huì)誘導(dǎo)eXact標(biāo)簽與目的蛋白之間的酶切，從而導(dǎo)致eXact標(biāo)簽被固定的蛋白酶滯留在介質(zhì)上，此時(shí)洗脫下來的就是6xHis-EYFP-Rab重組蛋白；
3. 使用Ni-NTA純化柱來純化6xHis-EYFP-Rab蛋白。

參考資料

1. 6xHis 標(biāo)簽的特點(diǎn)以及它的使用方法
2. Purification of proteins by IMAC
3. Janeway's Immunobiology 9th
4. Profinity IMAC 樹脂
5. Analysis of the Rab GTPase Interactome in Dendritic Cells Reveals Anti-microbial Functions of the Rab32 Complex in Bacterial Containment