文章概覽
題目：Single-Cell RNA-Seq Analysis of Infiltrating Neoplastic Cells at the Migrating Front of Human Glioblastoma
中文題目：人類膠質(zhì)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移邊界浸潤的惡性細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
第一作者：Spyros Darmanis
通訊作者：Stephen R.Quake
日期：2017.10.31
被引次數(shù)：297
期刊：Cell Reports
影響因子：8.109
引言
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 (GBM) 是成人中最常見的惡性原發(fā)性腦癌 (?Bush et al., 2016?)。先前已經(jīng)描述了個(gè)體 GBM 內(nèi)腫瘤細(xì)胞的患者間變異和分子多樣性（Patel et al., 2014)，但迄今為止的研究范圍僅限于腫瘤核心細(xì)胞的分子復(fù)雜性；現(xiàn)有的單細(xì)胞分辨率研究無法解決浸潤性 GBM 細(xì)胞或駐留在 GBM 內(nèi)部和周圍的其他神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、免疫和血管細(xì)胞類型的各種未探索的性質(zhì)。腫瘤微環(huán)境中這些細(xì)胞類型中的每一種之間的相互作用可能顯著促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和對治療的抵抗。
樣本信息
作者分別收集了四個(gè)IV 級?GBM患者（IDH-wt）兩個(gè)不同位置處的樣本：第一個(gè)位于腫瘤核心內(nèi)（Tumor），第二個(gè)來自腫瘤外周（Periphery）。作者使用細(xì)胞特異性標(biāo)記首先對樣本中的細(xì)胞進(jìn)行了篩選，特異性地捕獲了髓樣細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、（血管）上皮細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。測序后通過質(zhì)控的總共有3,589個(gè)細(xì)胞。
細(xì)胞類型鑒定
作者首先選擇了分散程度最高的基因（n = 500），并使用它們構(gòu)建了細(xì)胞間差異矩陣。然后對得到的距離矩陣執(zhí)行 tSNE。最后，在 2D tSNE 圖上使用 k-means 聚類，從而在不同的聚類中識別了 12 種不同的細(xì)胞類型（圖1）。
惡性細(xì)胞中約94%的細(xì)胞源自腫瘤核心。這些細(xì)胞顯著過度表達(dá)EGFR，該基因在所有GBM的30%–50%中上調(diào)，SOX9是一種在膠質(zhì)瘤中具有致癌作用的轉(zhuǎn)錄因子。有趣的是，EGFR和SOX9這兩個(gè)基因的聯(lián)合表達(dá)能夠以高靈敏度和特異性區(qū)分腫瘤細(xì)胞。缺氧基因PGK1、CA9、VEGFA、SPP1和HIF1A在腫瘤核心內(nèi)的表達(dá)明顯高于周圍區(qū)域。在2,343個(gè)腫瘤核心的細(xì)胞中，只有1,029個(gè)被鑒定為惡性細(xì)胞（~44%）。剩余的絕大多數(shù)細(xì)胞屬于免疫細(xì)胞（n=1,182, ~50%）、OPC（n=50, 2.13%），內(nèi)皮細(xì)胞(n=47, 2%)、OC(n=34, ～1.5%)或神經(jīng)元(n=1,～0.05%)。有趣的是，AC是唯一沒有在腫瘤核心中找到的正常細(xì)胞。
差異表達(dá)分析
腫瘤細(xì)胞具有將它們與大腦的其他細(xì)胞區(qū)分開來的共同特征。腫瘤細(xì)胞和非腫瘤細(xì)胞之間的差異表達(dá)分析 (DESeq2) 揭示了所有腫瘤細(xì)胞中富集的基因（圖2）。
不出所料，EGFR在顯示出最高的富集度。NFIB是另一種與大腦發(fā)育有關(guān)的腫瘤特異性轉(zhuǎn)錄因子（Campbell 等人，2008 年，Steele-Perkins 等人，2005 年），在誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞靜止和和促進(jìn)轉(zhuǎn)移（Denny 等人，2016 年）中起重要作用（Martynoga 等人，2013 年）。此外，轉(zhuǎn)錄因子SOX2和SOX9 上調(diào)，這也涉及大腦發(fā)育和譜系形成。SOX2與POU3F2、OLIG2和SALL2基因一起被報(bào)道為神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物（Suvà 等人，2014 年），而SOX9被證明與較差的臨床結(jié)果相關(guān)（Wang 等人， 2012 年）。CHL1是L1神經(jīng)細(xì)胞粘附分子家族的成員，參與發(fā)育中的新皮層中神經(jīng)元的遷移和定位。非腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)有許多是已知定義成熟、分化的 CNS 細(xì)胞類型的基因：MBP 和 OPALIN（OC）、GPR17（OPC）、 L1CAM（神經(jīng)元），以及 ALDH1L1、WIF1 和 NTSR2（AC）。
接下來作者對免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞不表達(dá)PD1和CTLA4配體的轉(zhuǎn)錄本，而 MHC I 類基因則相反。然而，患者內(nèi)部和患者之間存在高度異質(zhì)性。每個(gè)患者的腫瘤包括了屬于每個(gè)不同 Verhaak 分子亞型（Neural,?Classical, Mesenchymal, and Proneural subtypes）的細(xì)胞集合。
CNV分析
根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的CNV譜對細(xì)胞進(jìn)行聚類。得到的樹狀圖由三個(gè)主要分支組成（圖3A）：CNV1僅由腫瘤細(xì)胞組成，而CNV2和CNV3包含大部分非腫瘤細(xì)胞。CNV3包含所有CD45+的抗原呈遞細(xì)胞，CNV2由所有其他非腫瘤細(xì)胞組成。CNV2和CNV3分開的最可能原因是6號染色體上MHC II類基因的過度表達(dá)。CNV聚類和tSNE聚類判斷惡性細(xì)胞的結(jié)果一致。
腫瘤細(xì)胞的CNV 譜揭示了神經(jīng)膠質(zhì)瘤中兩個(gè)已被證實(shí)的染色體改變（圖3B）：7 號染色體的擴(kuò)增（包括EGFR?）和10 號染色體的缺失（包括PTEN和MGMT?）（Reifenberger 和 Collins，2004 年）。作者還對BT_S4樣本進(jìn)行了DNA測序，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測序的CNV結(jié)果。
基因組突變分析
BT_S1和BT_S6樣本發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)EGFR突變，BT_S4具有MAP1B突變，BT_S2具有TP53突變，具體情況如圖4。最上方一行代表樣本信息，第二行黑色的代表浸潤細(xì)胞（位于腫瘤核心外的惡性細(xì)胞）。紅色表示發(fā)生突變，藍(lán)色表示野生型，灰色表示該位置reads覆蓋率不足，無法確定。
GBM 浸潤細(xì)胞分析
盡管腫瘤簇內(nèi)的絕大多數(shù)細(xì)胞 (n = 1,029) 是從腫瘤核心收集的，但仍有少數(shù)來自外周組織 (n = 62)具有腫瘤特征的細(xì)胞（圖5A），這些細(xì)胞與腫瘤核心的細(xì)胞具有相同的CNV變異，表明是從腫瘤核心遷移出來的，稱為“浸潤細(xì)胞（infiltrating cells）”。與位于核心的細(xì)胞相比，浸潤細(xì)胞似乎下調(diào)了缺氧基因。
接下來作者對浸潤細(xì)胞和腫瘤核心細(xì)胞做了差異表達(dá)分析（圖5B）。在浸潤細(xì)胞富集的前十個(gè)基因中，我們發(fā)現(xiàn)了具有涉及間質(zhì)侵襲的基因，例如ATP1A2（也叫FXYD1)和PRODH。浸潤細(xì)胞還上調(diào)表達(dá)了細(xì)胞存活信號，F(xiàn)GFR3受體以及LMO3可以抑制TP53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。成纖維細(xì)胞生長因子(FGF) 信號傳導(dǎo)對胚胎發(fā)生過程中的細(xì)胞遷移很重要，而該通路的重新激活與前列腺腫瘤中的細(xì)胞遷移和侵襲有關(guān)。
對浸潤細(xì)胞上調(diào)的基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞遷移高度相關(guān)的GO term，例如細(xì)胞粘附（ECM2、 ANGPT1和TSPAN7 ）、陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)（TTYH1/2和AQP1）、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育（ BCAN、 HES6和GLI3）以及許多代謝過程。
?GBM 的浸潤細(xì)胞是否在遍布整個(gè)大腦并且發(fā)生增殖仍然是一個(gè)長期被關(guān)注的問題。作者由 MKI67 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)， 7.7% (80/1,029) 的腫瘤核心細(xì)胞正在發(fā)生增殖，而浸潤性細(xì)胞僅為 1.6% (1/62)。
免疫細(xì)胞分析
免疫細(xì)胞主要為巨噬細(xì)胞或小膠質(zhì)細(xì)胞（> 95%），其余細(xì)胞群主要由樹突細(xì)胞（DC）組成（~4.5%）。作者利用兩組已知的marker來鑒別腫瘤樣本和腫瘤外周樣本中的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。（TMEM119, P2RY12, GPR34, OLFML3, SLC2A5, SALL1, and ADORA3 for microglia and CRIP1, S100A8, S100A9, ANXA1, and CD14 for macrophages)(Bennett et?al., 2016)。根據(jù)這些基因的綜合表達(dá)，作者發(fā)現(xiàn)在腫瘤核心處，巨噬細(xì)胞占大多數(shù)（N(macrophage) = 813, N(microglia) = 365）；而在腫瘤外周，小膠質(zhì)細(xì)胞占大多數(shù)（N(macrophage) = 85, N(microglia) = 574）。
接下來作者檢查了腫瘤核心和外周的差異基因表達(dá)（圖6B），發(fā)現(xiàn)促炎分子在腫瘤外周表達(dá)，而抗炎和促血管生成因子在腫瘤核心表達(dá)。例如，炎癥標(biāo)志物IL1A/B在腫瘤外周被上調(diào)，而IL1RN是IL1A/B的抑制劑，它在腫瘤核心被上調(diào)，可以抑制免疫激活。腫瘤核心的免疫細(xì)胞中另一個(gè)高度富集的基因是TGFBI，TGFBI已被證明可以抑制細(xì)胞粘附并促進(jìn) DNA損傷細(xì)胞的存活，并且是潛在的血管生成因子，因此腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞可能對腫瘤的生長起到有益作用。腫瘤內(nèi)的免疫細(xì)胞似乎還通過表達(dá)血管生成因子VEGFA進(jìn)一步促進(jìn)血管通透性和內(nèi)皮細(xì)胞生長。
