本文選自nature communication，https://doi.org/10.1038/s41467-019-13571-x，喜歡的朋友可以自行下載閱讀。
不廢話，上圖。
先看一個(gè)結(jié)論：雌激素是肝臟中促轉(zhuǎn)移免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)劑，也是治療肝轉(zhuǎn)移疾病的潛在靶點(diǎn)。
摘要：這里探討了在調(diào)節(jié)結(jié)腸癌和肺癌LM的腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）中觀察到的一種性別二型性，其中雌性小鼠LM的髓源性抑制細(xì)胞（MDSC）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的積聚是tnfr2依賴(lài)的，而雄性小鼠則不是。在去卵巢小鼠中，大腸癌、肺癌和胰腺癌LM明顯減少，雌二醇重建可逆轉(zhuǎn)。這與肝MDSC積聚減少、CD8+T細(xì)胞γ-干擾素（IFN-γ）和顆粒酶B生成增加以及TNFR2、IDO2、TDO和SerpinB9表達(dá)水平降低有關(guān)。三苯氧胺治療可增加肝細(xì)胞毒性T細(xì)胞的積累，減少結(jié)腸癌LM。
本文基于作者前期的工作基礎(chǔ)，就是發(fā)現(xiàn)了TNFR2在雌性小鼠可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移免疫微環(huán)境從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程。當(dāng)在雄性小鼠中評(píng)估LM時(shí)，在通過(guò)脾內(nèi)/門(mén)靜脈途徑將年齡匹配的TNFR2陰性小鼠與結(jié)腸癌MC-38細(xì)胞接種后，我們發(fā)現(xiàn)這些小鼠的肝轉(zhuǎn)移數(shù)量與WT對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。
作者在雄性小鼠中發(fā)現(xiàn)腫瘤周?chē)嬖贛DSC浸潤(rùn)，但是與野生型相比，TNFR2-/-并未見(jiàn)明顯差異，并且流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)MDSC在免疫細(xì)胞的比例未見(jiàn)改變。在雄性WT小鼠中，表達(dá)TNFR2的CD11b+Gr-1+細(xì)胞的比例（30-40%）明顯低于雌性小鼠（75-90%）。
為了進(jìn)一步探討雄性和雌性小鼠的TIME差異，首先比較了荷瘤雄性和雌性小鼠在接種MC-38細(xì)胞后7天通過(guò)脾內(nèi)/門(mén)靜脈途徑肝臟中HIC的比例積累。FC顯示，從雄性小鼠收集到的HIC總數(shù)是從雌性小鼠收集到的總數(shù)的1.68倍，這可能是由于雄性肝臟的體積按比例增大。HIC免疫表型顯示，雄性小鼠的G-MDSC（CD11b+Ly6GHighLy6CMid）【M-MDSC（CD11b+Ly6CHighLy6GMid）】的平均每肝比例比雌性小鼠高4倍，雌性MDSC上TNFR2的表達(dá)顯著（3倍）高于雄性MDSC，雄性和雌性小鼠肝臟中的T淋巴細(xì)胞平均數(shù)量沒(méi)有顯著差異，盡管雌性小鼠肝臟中的NK細(xì)胞數(shù)量有所增加。這些數(shù)據(jù)表明，雄性和雌性小鼠在LM期的骨髓細(xì)胞募集可能受到不同的調(diào)節(jié)。
作者進(jìn)一步研究了激素調(diào)節(jié)在調(diào)控LM相關(guān)免疫微環(huán)境中的作用.雌性C57BL/6小鼠通過(guò)手術(shù)切除卵巢（OVX）來(lái)降低循環(huán)雌激素水平。卵巢切除術(shù)后3周證實(shí)子宮重量減輕，表明生理性激素水平下降。然后通過(guò)脾內(nèi)/門(mén)靜脈途徑注射MC-38或（肺癌）H-59細(xì)胞，在OVX和假手術(shù)對(duì)照小鼠中產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)性LM。此外，胰管腺癌（PDAC）的自發(fā)性轉(zhuǎn)移是由胰內(nèi)注射10e6 LMP細(xì)胞引起的。（選擇這些腫瘤模型是因?yàn)樗鼈兏叨绒D(zhuǎn)移到肝臟，代表性激素?zé)o關(guān)的組織腫瘤類(lèi)型，并且在疾病的臨床過(guò)程中轉(zhuǎn)移到肝臟）15-30天后處死小鼠并計(jì)數(shù)LM。與假手術(shù)對(duì)照組相比，在所有三組中，我們觀察到OVX小鼠肝轉(zhuǎn)移的數(shù)量顯著減少。石蠟包埋肝切片證實(shí)OVX小鼠LM數(shù)量和大小減少
胰腺內(nèi)注射LMP的原位腫瘤重量沒(méi)有差異。這些數(shù)據(jù)表明卵巢性激素促進(jìn)雌性小鼠結(jié)腸癌、肺癌和胰腺癌。
作者進(jìn)一步研究了雌激素所致的轉(zhuǎn)移是不是有器官特異性，用尾靜脈注射的方法制造實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下圖，所以說(shuō)，雌激素所致轉(zhuǎn)移具有器官特異性，這讓我想起了TIMP-1這個(gè)特異性肝轉(zhuǎn)移指標(biāo)。
卵巢切除并沒(méi)有降低TNFR2-/-小鼠實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，也沒(méi)有減少TNFR2-/-小鼠肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量，這表明肝臟中卵巢激素促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用可能與TNFR2信號(hào)有關(guān)。
作者下一步分析了卵巢雌激素對(duì)于LM轉(zhuǎn)移的影響。在接種MC-38細(xì)胞前1周皮下植入含有17β-E2的硅橡膠膠囊的OVX小鼠，并在腫瘤接種后15天分析LM。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）證實(shí)，盡管大多數(shù)OVX小鼠的血清E2濃度低于檢測(cè)水平，但植入β-E2膠囊的OVX小鼠的血清E2濃度恢復(fù)到正常范圍。重組E2可將肝轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)量恢復(fù)到對(duì)照水平，將其確定為對(duì)肝轉(zhuǎn)移瘤生長(zhǎng)最關(guān)鍵的雌激素。
雌激素對(duì)腫瘤生長(zhǎng)什么作用呢，作者進(jìn)一步作了MTT實(shí)驗(yàn)。β-E2對(duì)MC-38沒(méi)有顯著影響，LMP或H-59細(xì)胞在任何使用濃度下或在任何時(shí)間點(diǎn)（24、48和72小時(shí)）被檢測(cè)到增殖，盡管在類(lèi)似條件下，β-E2確實(shí)將作為陽(yáng)性對(duì)照的雌激素依賴(lài)性MCF-7細(xì)胞的增殖增加到與10%FBS完全培養(yǎng)基相似的水平。
既然作者都做到這個(gè)地步了，下面就開(kāi)始主角登場(chǎng)了，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一種異質(zhì)性的CD11b+Ly6C+Ly6G+髓樣細(xì)胞群，它們?cè)谀[瘤生長(zhǎng)部位發(fā)揮免疫抑制功能，包括抑制CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）和Treg的募集，基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者進(jìn)一步看看OVX是不是抑制了MDSC的招募。在接種MC-38后7d處死OVX和對(duì)照組小鼠，用FC和定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）分離和分析HIC。基因表達(dá)分析首先證實(shí)腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞和MDSCs表達(dá)ERα。
OVX小鼠肝臟中CD11b+Ly6C+Ly6G+的積累減少了2倍，這主要是由于G-MDSC（CD11b+Ly6CMidLy6GHigh）群體的顯著減少
這些細(xì)胞都存在于微轉(zhuǎn)移的邊緣，并且在OVX小鼠中顯示出減少積聚的趨勢(shì)。這對(duì)應(yīng)于相同邊緣內(nèi)CD8+T細(xì)胞數(shù)量的增加，沒(méi)有觀察到NK細(xì)胞積累的顯著差異，但我們確實(shí)觀察到雌激素缺乏小鼠CD11c+細(xì)胞積累的減少，此外，在OVX小鼠的肝臟中觀察到腫瘤相關(guān)的F4/80+巨噬細(xì)胞顯著減少，已知它們?cè)贚M進(jìn)展30中起重要作用（會(huì)不會(huì)是MDSC的成熟在雌激素作用下受到了抑制）。
安利一個(gè)CD11家族標(biāo)記的細(xì)胞類(lèi)型：CD11a：Positive staining (normal): all leukocytes CD11B: 單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞，NK細(xì)胞等；
CD11C：樹(shù)突細(xì)胞，單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞。
這種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)類(lèi)型是不是腫瘤特異性的呢，作者分別注射了肺和胰腺細(xì)胞進(jìn)行研究。通過(guò)脾內(nèi)/門(mén)靜脈途徑給OVX小鼠注射H-59肺癌和LMP-PDAC細(xì)胞，并通過(guò)FC分析TIME的組成
這些數(shù)據(jù)表明雌激素是肝轉(zhuǎn)移疾病發(fā)生TIME的一個(gè)重要的多功能調(diào)節(jié)因子。在移植LMP細(xì)胞的OVX小鼠胰腺中，G-MDSC和CD8+CTL在胰腺腫瘤中的蓄積與假手術(shù)組和雌激素恢復(fù)組相比無(wú)顯著性差異.與肝臟TIME相比，我們發(fā)現(xiàn)在胰腺中幾乎沒(méi)有Ly6CHighM-MDSC的積聚。在靜脈注射H-59細(xì)胞的小鼠肺中，在雌激素缺乏的情況下，CD8+CTL的積累沒(méi)有變化。
OVX對(duì)肺M-MDSC的積累無(wú)明顯影響，而G-MDSC在肺組織中的積累可忽略不計(jì)。這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了荷瘤小鼠肺、胰腺和肝臟中骨髓細(xì)胞積聚的器官特異性差異。
活化的CD8+T淋巴細(xì)胞是適應(yīng)性抗腫瘤免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)，其特征是產(chǎn)生干擾素γ（IFN-γ）。為了確定雌激素是否影響肝臟中T細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在體外用PMA and ionomycin刺激后，測(cè)定了從接種MC-38的OVX和假對(duì)照小鼠肝臟中分離的CD3+CD8+T細(xì)胞中IFN-γ的水平。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與對(duì)照組相比，從OVX小鼠分離的T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ增加了2倍，表明CTLs免疫應(yīng)答增強(qiáng)。granzyme B（GrzB）mRNA在這些細(xì)胞中的表達(dá)增加證實(shí)了FC的發(fā)現(xiàn)。由于雌激素缺乏并沒(méi)有顯著改變Foxp3+細(xì)胞的數(shù)量，活化T細(xì)胞的比例增加可能導(dǎo)致這些小鼠肝臟中更有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。(為什么用PMA and ionomycin刺激：1.PKC屬于下游的TCR信號(hào)，只會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和增殖，因此，PMA和Ionomycin的刺激后T細(xì)胞的活化和增殖能力改變，然而并不會(huì)改變T細(xì)胞的分化狀態(tài)。2.TCR信號(hào)的活化會(huì)激活所有的T細(xì)胞亞群，所以當(dāng)T細(xì)胞不同亞群的增殖速率不一樣時(shí)，各個(gè)T細(xì)胞亞群的原始比例就會(huì)因?yàn)榇碳ざl(fā)生改變。但是這種假說(shuō)很難加以證明，因?yàn)樵跊](méi)有刺激的情況下，胞內(nèi)因子很難被檢測(cè)到。3.因?yàn)門(mén)CR信號(hào)是很強(qiáng)很基礎(chǔ)的刺激，研究者更加傾向于認(rèn)為所有的T細(xì)胞亞群在TCR信號(hào)刺激下的增殖速度是一致的，所以在在體外進(jìn)行PMA和Ionomycin刺激后，仍然反映的是T細(xì)胞亞群在生物體體內(nèi)的原始比例。)，由此可見(jiàn)雌激素抑制了CD8+T活化，活化T細(xì)胞的比例增加可能導(dǎo)致這些小鼠肝臟產(chǎn)生更有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)。（盲猜作者會(huì)用PD-1）
SerpinB9(GrzB的抑制劑)、吲哚胺-2，3-雙加氧酶(IDO)和色氨酸-2，3-雙加氧酶(TDO；色氨酸分解代謝酶)是妊娠期間雌激素水平升高高度誘導(dǎo)的免疫抑制蛋白，以保護(hù)發(fā)育中的胎兒免受母體同種異體T細(xì)胞的影響。這些蛋白也可以由肝細(xì)胞和腫瘤相關(guān)的樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)，并與對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞34-36的免疫耐受有關(guān)。我們用qRT-PCR檢測(cè)了它們?cè)诟闻K中的表達(dá)水平，并觀察到OVX小鼠SerpinB9、IDO2和Tdo的表達(dá)降低了2倍以上，這表明雌激素參與了它們?cè)诟闻K中的表達(dá)調(diào)節(jié)。
作者既往發(fā)現(xiàn)TNFR2是雌性小鼠肝臟中的免疫抑制調(diào)節(jié)因子(即MDSC存活和功能），進(jìn)一步研究TNFR2的表達(dá)以及對(duì)腫瘤壞死因子-α的反應(yīng)是否受雌激素的調(diào)節(jié)。對(duì)浸潤(rùn)性MDSCs和Tregs進(jìn)行分離和免疫表型分析。與對(duì)照組相比，從去卵巢小鼠分離的單核細(xì)胞MDSCs(CD11b+Ly6CHighLy6GMid)和CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞中TNFR2的表達(dá)顯著降低，這可能是導(dǎo)致MDSC積聚減少和雌激素耗竭小鼠T細(xì)胞活化增加的原因。
從WT雌性小鼠收集的脾細(xì)胞經(jīng)10?7Mβ-E2體外處理后，TNFR2 mRNA的表達(dá)比賦形劑處理的對(duì)照組增加了3.5倍.來(lái)自O(shè)VX小鼠的LM浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞的IDO1表達(dá)顯著降低(圖7G)，證實(shí)了一種解除調(diào)節(jié)的功能。
作者還發(fā)現(xiàn)雌激素耗竭的OVX小鼠增加了DC的激活，這與更強(qiáng)大的抗腫瘤免疫是一致的。
為了確定卵巢切除是否也影響肝源性MDSC的功能，從而控制T細(xì)胞的expansion，作者進(jìn)行了一項(xiàng)以脾臟CD3+T細(xì)胞為靶點(diǎn)的抑制試驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)，與來(lái)自O(shè)VX小鼠肝臟的MDSC共孵育的T細(xì)胞比從假手術(shù)或OVX+E2肝臟獲得的MDSC孵育的T細(xì)胞具有更好的增殖能力。這證實(shí)了肝源性MDSC的免疫抑制功能，表明雌激素剝奪不僅改變了MDSC進(jìn)入肝臟的動(dòng)員，而且改變了它們的抑制功能。
為了確定這些綜合作用是否降低了轉(zhuǎn)移細(xì)胞在肝臟中增殖的能力，我們測(cè)量了腫瘤細(xì)胞中Ki-67的表達(dá)?？偠灾@些結(jié)果強(qiáng)烈暗示雌激素參與調(diào)節(jié)多種因素，包括TNFR2的表達(dá)，這些因素可以促進(jìn)肝臟的TIME。
既然雌激素作用這么好，那么家用雌激素抑制劑會(huì)對(duì)腫瘤肝轉(zhuǎn)移起到抑制作用嗎？給小鼠注射MC-38細(xì)胞，然后每周三次皮下注射4-羥基三苯氧胺或油作為載體。21d后處死小鼠，計(jì)數(shù)LM。在服用TMX的動(dòng)物中，觀察到與對(duì)照組相比，LM的數(shù)量顯著減少且呈劑量依賴(lài)性。在服用Tmx的小鼠中，肝臟MDSC的平均數(shù)量減少，從其肝臟提取的CTL中干擾素-γ的產(chǎn)生水平相應(yīng)增加2倍。這表明這些小鼠的抗腫瘤T細(xì)胞免疫增強(qiáng)。
全文結(jié)束，本文只是免疫相關(guān)的表型實(shí)驗(yàn)，沒(méi)有牽涉到機(jī)制部分，如果有興趣的同學(xué)可以進(jìn)一步探討這其中DC活化或者M(jìn)DSC動(dòng)員所包含的機(jī)制問(wèn)題，本文偏基礎(chǔ)，沒(méi)有臨床數(shù)據(jù)是這篇文章最大的敗筆，如何能讓讀者覺(jué)得這篇文章是緊密聯(lián)系臨床的呢？并沒(méi)有，本文明面有任何關(guān)于生存的圖，說(shuō)明了什么呢？如果最后在他莫昔芬+PD-1在腫瘤治療中用一用的話會(huì)不會(huì)對(duì)文章有點(diǎn)提升呢？歡迎批評(píng)、指正。
安利一個(gè)自發(fā)胰腺癌肝轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：Spontaneous PDAC LM：將1×106LMP細(xì)胞植入25μLMatrigel(紐約州康寧，美國(guó))混合25μL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的胰腺內(nèi)，觀察到自發(fā)性PDAC肝轉(zhuǎn)移。簡(jiǎn)而言之，B6.129小鼠用異氟醚麻醉。局部剃須消毒后，在左上腹作1.5cm縱向切口切開(kāi)腹腔。將體積為50μL的冰冷Matrigel/癌細(xì)胞混合物緩慢注射到胰腺實(shí)質(zhì)的尾部，使用冰冷的27號(hào)針頭和冰冷校準(zhǔn)的注射器。拔針前將針頭留在注射部位30s，以防滲漏。腫瘤植入后21-30天，動(dòng)物被安樂(lè)死，此時(shí)肝臟表面可見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶。做肝轉(zhuǎn)移有福氣了。
