今天分享一篇澳洲莫納什大學生殖健康中心Loveland博士課題組在《Human Reproduction》期刊上發(fā)表的WNT signalling in the normal human?adult testis and in male germ cell?neoplasms，影響因子為5.733分，屬于中科院SCI一區(qū)期刊。
doi:10.1093/humrep/deaa150
文章的關鍵術語
WNT signalling
spermatogenesis 精子發(fā)生
testicular germ cell tumor/TGCT睪丸生殖細胞瘤
研究主旨
本研究闡明了WNT信號通路在人睪丸中正常和腫瘤生殖細胞發(fā)揮的作用。這項研究采用了幾種組織學方法，確立了參與WNT信號通路的蛋白在人睪丸中的表達定位圖譜。同時Loveland博士課題組還鑒定出特定階段和細胞類型是否直接受到WNT配體的影響。另外，該課題組還利用了TCam-2精原細胞瘤細胞系確定抑制信號通路的功能影響，以為篩選出治療生殖細胞瘤的合適靶點。
WNT信號通路調控著各種生命活動的過程，包括生殖細胞生長發(fā)育。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，WNT信號通路的改變也發(fā)揮著一定作用，但目前尚未明確TGCT里WNT通路的成分和功能。
研究思路
該課題組在組織、細胞、分子水平上通過免疫組化、原位雜交、PCR和細胞活力檢測都做了驗證，而且文章能吸引讀者，原創(chuàng)性高，所以最終能發(fā)表在5.733分期刊上。
得到病人的知情同意后，收集睪丸癌組織樣本以及正常睪丸組織樣本，做石蠟包埋切片。
利用TCam-2和SW480細胞系進行體外細胞培養(yǎng)。
反轉錄PCR得到CTNNB1和AXIN2的cDNA后，轉導入DH5α細菌細胞，用菌落PCR篩選和測序進行驗證。之后，制備好的石蠟切片用蛋白酶K處理，接著用cRNA探針做原位雜交。
從TCam-2細胞、SW480細胞和受精后12.5天的小鼠胚胎中分離出RNA，接著做Northern blot分析。
在正常睪丸組織和睪丸癌組織切片上做免疫組化分析，檢測CTNNB1、TCF7L1、TCF7L2。
細胞爬片和免疫熒光分析，檢測CTNNB1、TCF7L1、TCF7L2在TCam-2細胞的表達定位分布。
siRNA實驗：接種培養(yǎng)TCam-2細胞后，用RNAiMAX系統(tǒng)做轉染，siRNA結合于TCF7L1和TCF7L2并轉染到TCam-2細胞中。未處理的TCam-2細胞和陰性對照siRNA作為對照。轉染后1、3、5天后收集TCam-2細胞進行RNA分析。再用qRT-PCR做基因敲除鑒定。
qRT-PCR實驗：從TCam-2細胞中分離RNA，反轉錄成cDNA，然后上樣跑PCR。
細胞數(shù)量和細胞活力檢測
細胞遷移實驗
研究結果
在正常人睪丸切片上做原位雜交檢測WNT通路的CTNNB1和AXIN2的定位情況，發(fā)現(xiàn)典型的WNT通路在生精細胞中較為活躍。
免疫組化法檢測睪丸生殖細胞瘤GCNIS切片上的WNT通路的信號分子CTNNB1、WNT3A、TCF-1、TCF7L1、TCF7L2的表達定位分布情況，發(fā)現(xiàn)CTNNB1蛋白主要存在于GCNIS的細胞質和支持細胞里，WNT3A則在支持細胞里表達量很少，但主要表達在生精小管周圍的間質區(qū)域內。TCF-1在GCNIS細胞核內和支持細胞都有表達。TCF7L1和TCF7L2只表達在GCNIS細胞核內。
免疫組化檢測精原細胞瘤上WNT通路信號分子的定位分布情況，發(fā)現(xiàn)了CTNNB1分布在細胞漿內。WNT3A分布在周圍細胞之間，似乎表明了免疫浸潤現(xiàn)象的出現(xiàn)。
這圖表明了TCam-2細胞能夠受WNT的刺激而作出反應，則會快速把CTNNB1在核內積累到一定程度。
以下這圖表明了WNT拮抗劑顯著影響了TCam-2細胞的生長發(fā)育和遷移，TCam-2對WNT拮抗劑主要作用在通路的兩個特定位點：IWR-1（破壞復合體的穩(wěn)定性增加）以及CCT036477（抑制CTNNB1-TCF/LEF之間的相互作用）。
這圖顯示了抑制WNT信號通路能抑制TCam-2細胞的遷移，但當在5%血清培養(yǎng)時未必影響其細胞數(shù)量。
這圖表明了抑制TCam-2細胞內TCF7L1和TCF7L2的抑制會導致遷移能力的下降。
終上所述，這項研究提供了新的證據(jù)，表明WNT信號通路在正常的精子發(fā)生過程中保持活躍的狀態(tài)，也在生殖細胞瘤內呈現(xiàn)出相關性。抑制生殖細胞瘤內的WNT通路會減弱細胞生存能力和遷移力，這可為日后使用小分子（siRNA）抑制劑作為治療轉移性TGCT提供有力的證據(jù)。
以上圖片均來源于https://doi.org/10.1093/humrep/deaa150
