CRISPR是一個(gè)不斷突破現(xiàn)有認(rèn)知的技術(shù)工具，不僅可以實(shí)現(xiàn)基因敲除/突變/敲入，現(xiàn)在它還可以做基因過(guò)表達(dá)/基因沉默/基因調(diào)控等，接下來(lái)為您仔細(xì)介紹一下這位“斜桿青年”。
在生物學(xué)研究中，CRISPR-gRNA文庫(kù)是一種高通量篩選靶基因的工具，可大規(guī)模或全基因組進(jìn)行功能篩選，涉及信號(hào)通路、疾病、細(xì)胞藥物應(yīng)答、發(fā)育、基因調(diào)控等方面，高分的研究成果層出不窮。海星生物在gRNA文庫(kù)篩選方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，能夠幫助客戶快速應(yīng)用最新的技術(shù)構(gòu)建CRISPR KO（基因敲除）、CRISPRa（基因激活）文庫(kù)、CRISPRi（基因抑制/沉默），并提供全套的細(xì)胞功能篩選服務(wù)，涵括文庫(kù)構(gòu)建、病毒文庫(kù)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選、NGS測(cè)序與數(shù)據(jù)分析服務(wù)。下面就和我們一起仔細(xì)了解這些新的應(yīng)用技術(shù)吧！
01、CRISPRa（基因激活）
CRISPRa（基因激活）系統(tǒng)是用于激活內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)大工具，切割失活的Cas9（dCas9）連上轉(zhuǎn)錄激活子（如VP64、p65和HSF1），可以有效促進(jìn)基因組特定位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄。研究顯示，CRISPRa技術(shù)可以使得基因的轉(zhuǎn)錄得到了兩倍到數(shù)千倍的增長(zhǎng)，許多基因的活性甚至有了幾個(gè)數(shù)量級(jí)的增加。
服務(wù)的內(nèi)容：客戶提供相關(guān)的需要激活表達(dá)的基因信息，海星生物將按照基因的生物信息特點(diǎn)，設(shè)計(jì)gRNA、構(gòu)建載體、包裝病毒通過(guò)病毒轉(zhuǎn)染到目的細(xì)胞，篩選出激高表達(dá)或者合適的gRNA序列，并構(gòu)建成CRISPRa穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，并使用Q-PCR對(duì)目的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，并依據(jù)客戶的需求提供單克隆建立和表型的篩選服務(wù)。
服務(wù)優(yōu)勢(shì)：通過(guò)內(nèi)源基因組背景進(jìn)行激活，激活表達(dá)量可以從2倍到幾個(gè)數(shù)量級(jí)的提升。
02、CRISPRi（基因抑制/沉默）
RISPRi （基因抑制/沉默）系統(tǒng)是用于抑制內(nèi)源性基因轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)大工具，當(dāng)dCas9（沒(méi)有切割活性的Cas9）被引導(dǎo)到靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS（transcription start site）時(shí)，dCas9能夠物理性阻礙RNA聚合酶的通過(guò)，導(dǎo)致基因沉默。同時(shí)dCas9融合了一個(gè)基因抑制結(jié)構(gòu)域，如KRAB結(jié)構(gòu)域，這樣的蛋白稱之為dCas9-KRAB，可以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄抑制的效率。此外，dCas9也可以融合雙抑制結(jié)構(gòu)域KRAB-MeCP2，抑制效果更佳。
由于dCas9-KRAB CRISPRi系統(tǒng)是在DNA水平抑制基因表達(dá)，因此適用于多種類型的基因，包括：mRNA、非編碼RNA、microRNA、反義轉(zhuǎn)錄本、核定位RNA以及聚合酶III 轉(zhuǎn)錄本等基因的轉(zhuǎn)錄抑制。
服務(wù)內(nèi)容：
客戶只需要提供要進(jìn)行敲減的基因和轉(zhuǎn)錄本信息，將有海星生物設(shè)計(jì)gRNA序列，構(gòu)建病毒載體，病毒包裝后轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞，并根據(jù)客戶的需求進(jìn)行篩選出符合敲減水平低gRNA，并提供CRISPRi穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建和單克隆的擴(kuò)增篩選的服務(wù)。
技術(shù)優(yōu)勢(shì)：
不改變內(nèi)源基因組背景、基因抑制效果可篩選、適用更多基因種類。
RNAi vs CRISPRi
研究基因功能最常見(jiàn)的方法是，減少或者阻斷基因表達(dá)，然后進(jìn)行表型分析。RNAi和CRISPRi都是常用的基因表達(dá)水平敲低的研究工具。
RNA干擾（RNAi）靶向細(xì)胞質(zhì)中成熟的RNA，而CRISPRi則在細(xì)胞核內(nèi)阻止轉(zhuǎn)錄的起始，因而敲低效果更為顯著。此外RNAi的脫靶效應(yīng)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CRISPRi。
