生物體正常的生理功能依賴于復(fù)雜的細(xì)胞及分子通過(guò)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)相互作用推進(jìn)和完成，生物體的復(fù)雜程度在細(xì)胞類型、細(xì)胞比例、細(xì)胞的空間位置、細(xì)胞的基因表達(dá)、細(xì)胞間的通訊互作、染色質(zhì)的狀態(tài)、基因的序列等眾多維度實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)調(diào)控。單細(xì)胞測(cè)序作為新出現(xiàn)的強(qiáng)有力工具，正是解析細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的合適技術(shù)手段，它通過(guò)一次性對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，繪制出組織或器官的細(xì)胞圖譜，明確細(xì)胞間的調(diào)控模式和狀態(tài)變化，為解析生命機(jī)制提供細(xì)胞層次分辨率的系統(tǒng)見(jiàn)解。隨著對(duì)科學(xué)研究的不斷深入，單細(xì)胞測(cè)序（ScRNA-seq）的帝國(guó)包含了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、單細(xì)胞ATAC測(cè)序和單細(xì)胞免疫組等幾個(gè)重量級(jí)產(chǎn)品，在不同水平揭示了組織內(nèi)部的異質(zhì)性。近期，有越來(lái)越多的研究者關(guān)注了單細(xì)胞核測(cè)序（SnRNA-seq）。相較于ScRNA-seq的針對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，SnRNA-seq制備單細(xì)胞核懸液，針對(duì)單個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行測(cè)序和分析。今天，小編為大家詳細(xì)比較以下兩者的優(yōu)劣勢(shì)，看看兩者更適用于怎樣的研究場(chǎng)景。
ScRNA-seq的局限
1、 僅適用于新鮮組織樣本
影響ScRNA-seq結(jié)果的關(guān)鍵因素是單細(xì)胞懸液的質(zhì)量，ScRNA-seq對(duì)細(xì)胞懸液的質(zhì)量要求非常高（細(xì)胞數(shù)量、活性、濃度、背景干擾等），因此細(xì)胞懸液的制備只適用于新鮮組織或者凍存后復(fù)蘇組織（主要是前者），這限制了ScRNA-seq的應(yīng)用范圍，意味著保存在超低溫冰箱中、具有重要科研和臨床價(jià)值的大量珍貴樣本無(wú)法進(jìn)行scRNA測(cè)序。
2、解離導(dǎo)致某些細(xì)胞類型的丟失
眾所周知，解離過(guò)程中不同類型細(xì)胞在解離效率上存在差異，與免疫細(xì)胞相比，成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞更多嵌于細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜中，因此更難以分解【2】；同時(shí)一些較為敏感的細(xì)胞可能會(huì)因?yàn)榻怆x過(guò)度而破碎，因此解離過(guò)程大概率無(wú)法有效的獲取到組織中的所有細(xì)胞類型，導(dǎo)致結(jié)果的準(zhǔn)確性大為降低。
3、不適用于含大細(xì)胞的樣本類型
部分樣本類型，例如心臟、肌肉、脂肪組織含有直徑較大的心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和成熟的脂肪細(xì)胞，這些細(xì)胞的共同點(diǎn)均是“大”，例如心臟中大的心肌細(xì)胞，長(zhǎng)和寬分別能達(dá)到100μm/25μm，而目前商業(yè)化的單細(xì)胞平臺(tái)對(duì)細(xì)胞大小均有限制，以10X Genomics平臺(tái)為例，其芯片中微管道直徑為50μm，建議捕獲的細(xì)胞不要超過(guò)40μm，因此上機(jī)捕獲前需要經(jīng)過(guò)30-40μm細(xì)胞篩過(guò)濾去除大細(xì)胞。如果研究的樣本類型為心臟、脂肪等且關(guān)注心肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞信息，ScRNA-seq就不再是一個(gè)合適的選擇。
基于以上列出的ScRNA-seq的局限性，SnRNA-seq開(kāi)始在一些研究中被廣泛應(yīng)用，以腦組織單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組研究為例，目前大多數(shù)文章更傾向于實(shí)用SnRNA-seq，包括神經(jīng)細(xì)胞【3-5】、心臟【6、7】、腎臟【8、9】、肝臟【10、11】、脂肪【12、13】等。
SnRNA-seq的優(yōu)勢(shì)
已經(jīng)有大量文獻(xiàn)證明，SnRNA-seq能夠解決ScRNA-seq中存在的主要問(wèn)題，其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)如下：
1、適用樣本類型豐富，操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)單
由于核膜穩(wěn)定性比細(xì)胞膜高，因此組織凍存后細(xì)胞核膜不會(huì)被破壞，因此凍存組織可以提核做SnRNA-seq，提高了單細(xì)胞測(cè)序的樣本類型和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)豐富度。
2、降低人為引入的轉(zhuǎn)錄偏差
因?yàn)榻M織可以直接從凍存狀態(tài)開(kāi)始抽核，此狀態(tài)下細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活動(dòng)已經(jīng)被抑制并固定，因此不會(huì)再發(fā)生轉(zhuǎn)錄狀態(tài)改變，結(jié)果真實(shí)性提高。
3、相對(duì)提高細(xì)胞類型的全面性
直接凍存狀態(tài)下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行機(jī)械破碎或者化學(xué)破碎，不會(huì)再出現(xiàn)酶解法引入的解離偏好性，相對(duì)而言細(xì)胞回收的全面性更高。通過(guò)比較分析了腎臟組織利用dropseq和10x兩種平臺(tái)的ScRNA-seq和SnRNA-seq的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)SnRNA-seq的結(jié)果中包含了很多在scRNA中不存在的細(xì)胞類型，腎小球足細(xì)胞的比例增加了20倍【14】。
SnRNA-seq的劣勢(shì)
雖然SnRNA-seq相比較ScRNA-seq具有多方面的優(yōu)勢(shì)，但同樣SnRNA-seq的劣勢(shì)也比較明顯：
1、檢測(cè)到的基因少
SnRNA-seq只能檢測(cè)細(xì)胞核中的mRNA, 缺失對(duì)細(xì)胞質(zhì)中的mRNA分子的檢測(cè)。同時(shí)由于細(xì)胞核中帶有polyA尾的成熟mRNA比例更低，因此對(duì)于某些樣本而言，采用SnRNA-seq每個(gè)細(xì)胞核中檢測(cè)到的基因會(huì)偏少，不利于細(xì)胞亞型的鑒定。
2、獲得免疫細(xì)胞較少
雖然上文提到SnRNA-seq可以提高細(xì)胞檢測(cè)的全面性，但是其在某些細(xì)胞類型的再現(xiàn)上并沒(méi)有優(yōu)勢(shì)。2020年發(fā)表在Nature Medicine的一篇文章【15】，對(duì)不同腫瘤類型的新鮮/冷凍樣本進(jìn)行ScRNA-seq和SnRNA-seq， 結(jié)果顯示兩種方法檢測(cè)到的細(xì)胞類型相似，但比例差別較大：在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中， 相比SnRNA-seq，ScRNA-Seq中免疫細(xì)胞比例更高，神經(jīng)嵴、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞大幅減少；而SnRNA-Seq結(jié)果中實(shí)質(zhì)性細(xì)胞（尤其是惡性細(xì)胞）比例更高，但是T細(xì)胞大幅減少，B細(xì)胞和NK細(xì)胞基本消失，內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞增加。
總結(jié)
總體而言，若針對(duì)凍存樣本、細(xì)胞直徑大于40um以及相對(duì)較難解離的植物樣本，建議采用SnRNA-seq；一些較難解離的動(dòng)物樣本，派森諾的單細(xì)胞研發(fā)團(tuán)隊(duì)可提供一對(duì)一個(gè)性化的解離方案，讓科學(xué)研究多一種選擇。某些具體情況，則要根據(jù)研究目的進(jìn)行個(gè)性化地調(diào)整。例如，關(guān)注肝癌樣本中的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，SnRNA-seq是更佳的方案；關(guān)注肝癌樣本中的免疫細(xì)胞，ScRNA-seq是更加方案。若關(guān)注肝癌樣本中的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞，則可聯(lián)系您身邊的派森諾銷售，讓派森諾的資深技術(shù)支持，提供個(gè)性化的實(shí)驗(yàn)方案。
參考文獻(xiàn)：
https://www.cn-healthcare.com/articlewm/20210611/content-1230956.html
1、Defining cell types and states with single-cell genomics
2、Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations
3、A single-nuclei RNA sequencing study of Mendelian and sporadic AD in the human brain
4、Alzheimer's Patient Microglia Exhibit Enhanced Aging and Unique Transcriptional Activation
5、A Spatiomolecular Map of the Striatum
6、Cells of the adult human heart
7、Transcriptional heterogeneity of fibroblasts is a hallmark of the aging heart
8、A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys
9、Complementary Roles for Single-Nucleus and Single-Cell RNA Sequencing in Kidney Disease Research
10、Single-Nuclei RNA Sequencing Assessment of the Hepatic Effects of 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin
11、Characterizing the Heterogeneity of Liver Cell Populations Under a NASH-Related Hepatotoxicant Using Single-Nuclei RNA Sequencing
12、Plasticity of Epididymal Adipose Tissue in Response to Diet-Induced Obesity at Single-Nucleus Resolution
13、SnRNA-seq reveals a subpopulation of adipocytes that regulates thermogenesis
14、Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis
15、A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors
