Expression pattern of secretory-cell-related transcriptional signatures in colon adenocarcinomas defines tumor microenvironment characteristics and correlates with clinical outcomes

結(jié)腸腺癌中分泌細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄特征的表達模式定義了腫瘤微環(huán)境特征并與臨床結(jié)果相關(guān)聯(lián)

發(fā)表期刊：Mol Oncol

發(fā)表日期：2022 Nov 8

影響因子：7.449

DOI:? 10.1002/1878-0261.13338

一、研究背景

????????腸粘膜中細(xì)胞增殖、分化和凋亡之間的平衡被破壞，導(dǎo)致粘膜穩(wěn)態(tài)環(huán)境失調(diào)是結(jié)腸癌的早期征兆之一。在結(jié)腸粘膜的各種細(xì)胞類型中，分泌細(xì)胞代表了分化細(xì)胞的主要群體之一，由于這些細(xì)胞與不同的含粘液結(jié)腸癌組織學(xué)亞型密切相關(guān)，它們在驅(qū)動一部分結(jié)腸癌中的作用受到了廣泛關(guān)注。

????????腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和腺泡細(xì)胞是兩種主要的分泌細(xì)胞類型。兩者都來自LGR5+多能干細(xì)胞，其分化途徑受Notch信號控制。在生理上，為了應(yīng)對腔內(nèi)刺激，腸道內(nèi)分泌細(xì)胞會分泌各種肽類激素，分別以傳統(tǒng)的內(nèi)分泌和旁分泌方式作用于遠(yuǎn)處的器官和鄰近的細(xì)胞，而吞咽細(xì)胞會排出其粘蛋白顆粒，與水、鹽和其他蛋白質(zhì)結(jié)合。

????????此外，在腸道炎癥期間，分泌細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的機理和生化交叉對話已被大量研究證實，這也促使分泌細(xì)胞在塑造結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境（TME）異質(zhì)性中的潛在作用。因此，更全面地了解分泌細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用，將有助于加深我們對癌癥免疫的理解。

二、材料與方法

1 、數(shù)據(jù)來源

1） GEO數(shù)據(jù)集：GSE17538、GSE33113、GSE37892、GSE38832和GSE39582

2） TCGA數(shù)據(jù)集

3） 中山大學(xué)腫瘤中心組織學(xué)診斷為非轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的30個新鮮樣本的RNA測序數(shù)據(jù)，作為外部驗證隊列

2、分析流程

流程圖

三、實驗結(jié)果

01 - 與分泌細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄特征的表達水平相關(guān)的TME、生物學(xué)和臨床特征

????????作者首先探討了分泌細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄特征的表達水平在結(jié)腸癌患者腫瘤中的作用。如圖1A所示，在meta-GEO和TCGA-COAD隊列中，腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和亞型2吞噬細(xì)胞特征的表達水平存在明顯的正相關(guān)，而亞型1吞噬細(xì)胞特征的表達水平則與上述兩種細(xì)胞類型特征無關(guān)。在分泌細(xì)胞相關(guān)特征的PCA評分與TME細(xì)胞相關(guān)特征的相關(guān)性方面（圖1A，左），發(fā)現(xiàn)在meta-GEO和TCGA-COAD隊列中，腸內(nèi)分泌細(xì)胞和亞型2型吞噬細(xì)胞特征的PCA評分都與基質(zhì)細(xì)胞和一些骨髓細(xì)胞類型的評分表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)。相應(yīng)地，腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和2型鵝口瘡細(xì)胞特征的PCA評分與基質(zhì)相關(guān)途徑的激活水平之間也存在高度顯著的正相關(guān)（圖1A，右）。接下來的KEGG分析不僅證實了基質(zhì)相關(guān)途徑的激活程度與腸內(nèi)分泌細(xì)胞和亞型2腺細(xì)胞的PCA分?jǐn)?shù)之間的正相關(guān)，而且還發(fā)現(xiàn)亞型1腺細(xì)胞特征的估計分?jǐn)?shù)與多種細(xì)胞代謝途徑之間存在明顯的正相關(guān)。在meta-GEO和TCGA-COAD隊列中，比較不同共識分子亞型（CMS）中分泌細(xì)胞相關(guān)特征的富集程度，發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)分泌細(xì)胞和亞型2吞咽細(xì)胞特征的PCA得分在CMS4患者的組織中最高，這主要代表基質(zhì)/間質(zhì)表型；亞型1吞咽細(xì)胞特征的得分在CMS3患者的組織中最高，該亞型以突出代謝激活為特征（圖1B)。

????????接下來探討了結(jié)腸癌患者中分泌細(xì)胞相關(guān)特征的表達水平的臨床意義。如圖1C所示，與亞型腺泡細(xì)胞不同，其PCA評分與患者的生存率沒有明顯的相關(guān)性，而腸內(nèi)分泌細(xì)胞和亞型腺泡細(xì)胞特征的水平較高，表明復(fù)發(fā)的風(fēng)險明顯較高。在總生存期（OS）中，發(fā)現(xiàn)腸內(nèi)分泌細(xì)胞和2型小腸球菌細(xì)胞特征的PCA評分與OS時間的負(fù)相關(guān)關(guān)系僅在接受輔助化療（ADJC）的患者中顯著，這表明腸內(nèi)分泌細(xì)胞和2型小腸球菌細(xì)胞的存在可能與化療耐藥有關(guān)（圖1C）。為了驗證這一假設(shè)，分析了GSE39582和TCGA-COAD隊列中分泌細(xì)胞相關(guān)特征的PCA得分與化療獲益之間的關(guān)系（圖1D）。結(jié)果顯示，在具有高度富集的腸內(nèi)分泌細(xì)胞和2型嗜酸細(xì)胞特征的患者中，ADJC增加了死亡率風(fēng)險（圖1D）。同時，在氟尿嘧啶無反應(yīng)組中，腸內(nèi)分泌細(xì)胞和亞型嗜酸細(xì)胞特征的富集水平明顯高于氟尿嘧啶反應(yīng)組，而亞型嗜酸細(xì)胞特征在氟尿嘧啶反應(yīng)組中明顯富集（圖1E）。綜上所述，這些結(jié)果表明，分泌細(xì)胞，特別是腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和亞型2腺泡細(xì)胞的富集水平可能是結(jié)腸癌預(yù)后和化療反應(yīng)的潛在預(yù)測因素。

圖1????分泌細(xì)胞PCA評分的臨床相關(guān)性、腫瘤微環(huán)境特征和生物學(xué)功能特征。

02 - 識別分泌細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志性表達模式

????????為了識別結(jié)腸癌中分泌細(xì)胞相關(guān)的特征表達模式，采用了無監(jiān)督的K-均值聚類算法，該算法基于meta-GEO和TCGA-COAD隊列中的腸內(nèi)分泌細(xì)胞、1型嗜酸細(xì)胞和2型嗜酸細(xì)胞特征的PCA得分。如圖2A,B所示，四種不同的分泌細(xì)胞相關(guān)特征的表達模式取得了最佳的聚類效果，并相應(yīng)地將患者分為SCS1、SCS2、SCS3和SCS4亞型。其中，SCS1、SCS2和SCS3的樣本對腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和亞型消化道細(xì)胞特征的富集程度分別為中等、最高和最低，而SCS4則對亞型消化道細(xì)胞特征表現(xiàn)出密集的富集。隨后的生存分析顯示，SCS2亞型患者的無復(fù)發(fā)生存期（RFS）明顯短于其他SCS亞型的患者（圖2C）。至于OS，與腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和2號亞型腺體細(xì)胞特征的PCA評分的單變量生存分析結(jié)果類似，在GSE39582（圖2C,D）和TCGA-COAD隊列中（圖2E,F），SCS2只在接受ADJC的患者亞組中表現(xiàn)出明顯比其他亞型差的預(yù)后。在化療獲益方面，森林圖（圖2G）和堆積直方圖（圖2H）顯示，在GSE39582中，ADJC的表現(xiàn)使SCS2患者的死亡風(fēng)險增加2倍以上。TCGA-COAD隊列中，氟尿嘧啶反應(yīng)率也是SCS2亞型患者中最低的。相比之下，腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和2號亞型腺泡細(xì)胞特征富集水平最低的SCS3患者對氟尿嘧啶的反應(yīng)率最高。綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，SCS2患者的臨床特征主要歸因于腫瘤組織中腸內(nèi)分泌細(xì)胞和2號亞型腺泡細(xì)胞特征的高度富集。

圖2 基于PCA得分的結(jié)腸癌分泌細(xì)胞相關(guān)特征的共識聚類法

????????由于分泌細(xì)胞相關(guān)特征的PCA分?jǐn)?shù)已被證明與各類TME細(xì)胞相關(guān)特征的表達水平相關(guān)，進一步比較了SCS亞型中的TME細(xì)胞相關(guān)特征?；赑CA算法，發(fā)現(xiàn)SCS亞型顯示出不同的TME細(xì)胞相關(guān)特征的富集（圖3A-D）。在SCS2中，多種基質(zhì)細(xì)胞和具有免疫抑制特性的先天免疫細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的PCA得分顯示出最高水平。這表明SCS2樣本的TME可能被歸類為 "免疫排斥"表型的特征。相比之下，SCS3的TME特征與 "免疫沙漠 "表型相似，因為大多數(shù)TME細(xì)胞特征在SCS3樣本中的富集程度最低。幾乎所有TME細(xì)胞類型的PCA得分在SCS1樣本中都顯示出中等水平。此外，發(fā)現(xiàn)與其他亞型相比，SCS2的瘤內(nèi)異質(zhì)性最高（圖3E），腫瘤純度最低（圖3F）。然而，不同SCS亞型之間的腫瘤突變負(fù)擔(dān)（圖3G）和新抗原數(shù)量（圖3H）沒有明顯差異。

????????然后，通過對標(biāo)志基因和KEGG基因集進行PCA算法，研究了與每個SCS亞型相關(guān)的通路激活情況。如圖3I-L所示，基質(zhì)相關(guān)通路和炎癥相關(guān)通路在SCS2患者中被高度激活，但在SC3患者中被明顯抑制。此外，KRAS信號傳導(dǎo)在SCS2患者中被高度激活，表明KRAS信號傳導(dǎo)可能在SCS2腫瘤的進展中發(fā)揮重要作用。最后（圖3M,N），發(fā)現(xiàn)SCS2患者主要集中在顯示基質(zhì)特性的多個亞型，包括HMC4、C4（CIT）、CMS4、TMEC2、Sub 3和C6（Pan-Immune，TCGA）亞型，而幾乎所有SCS4患者都富集在CMS3。然而，在GSE39582和TCGA-COAD隊列中，不同SCS亞型患者的錯配修復(fù)（MMR）或微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）狀態(tài)的分布并不一致。總之，這些結(jié)果表明，SCS2患者主要表現(xiàn)出基質(zhì)相關(guān)的TME和生物學(xué)特征，這可能是該亞型患者化療抵抗的原因之一。

圖3 不同SCS亞型的腫瘤微環(huán)境和生物學(xué)功能特征

????????為了更好地了解不同SCS亞型的生物學(xué)特征，作者在TCGA-COAD隊列中進行了多組學(xué)分析。首先，關(guān)于SMGs在不同SCS亞型中的有效突變分布，發(fā)現(xiàn)KRAS在整個、MSI高（MSI-H）和微衛(wèi)星穩(wěn)定/MSI低（MSS/MSI-L）患者隊列中SCS4亞型的突變率最高（圖4A），并且KRAS突變與1亞型腺泡細(xì)胞特征的PCA評分高度相關(guān)（圖4B）。有趣的是，在整個和MSS/MSI-L隊列中，SCS4亞型的TP53突變率明顯低于其他SCS亞型（圖4A），TP53突變與預(yù)測的氟尿嘧啶AUC值高度相關(guān)（圖4B）。值得注意的是，在MSS/MSI-L隊列中，與其他SCS亞型相比，BRAF突變在SCS2患者中明顯富集。

????????除了基因組突變外，還探討了SCS亞型之間基因啟動子甲基化水平的差異。如圖4C所示，共發(fā)現(xiàn)36個SVMG。在這些基因中，HYAL1、CAPN8、REG4和NAT2的甲基化程度高，轉(zhuǎn)錄表達量低，而其他基因的甲基化程度低，SCS2亞型的轉(zhuǎn)錄表達量高，這表明這些基因的甲基化可能在SCS2患者的生物學(xué)特征中起重要作用。這些SVMG的甲基化水平與分泌細(xì)胞相關(guān)特征的PCA得分和預(yù)測的氟尿嘧啶AUC值的關(guān)聯(lián)見圖4D。

????????最后，從TCGA-COAD隊列中下載了蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致（圖4E,F），SCS2亞型中纖維蛋白和IV型膠原蛋白等間質(zhì)標(biāo)志物的蛋白表達量很高，而上皮標(biāo)志物E-cadherin的蛋白表達量明顯下降，這進一步證實SCS2在蛋白水平上存在基質(zhì)途徑的高度激活。

圖4 SCS亞型相關(guān)的基因組改變和甲基化特征

03 - 在meta-GEO隊列中構(gòu)建SCS評分并探索其臨床相關(guān)性

????????由于SCS2亞型的患者預(yù)后較差，不能從氟尿嘧啶治療中獲益，作者認(rèn)為有必要開發(fā)一個簡單的評分工具，以準(zhǔn)確識別臨床實踐中的此類患者，并協(xié)助TNM分期，指導(dǎo)結(jié)腸癌的ADJC表現(xiàn)。在GSE39582隊列中確定了628個DEGs，并先后使用Boruta降維和LASSO-Cox回歸分析，建立了由七個基因組成的評分模型，稱為SCS評分（圖5A）。在這些基因中，ASCL2和FAM84A在SCS2亞型中下調(diào)，其表達水平與復(fù)發(fā)風(fēng)險顯著負(fù)相關(guān)。其他五個基因在SCS2患者中高表達，它們的過度表達與較差的RFS明顯相關(guān)（圖5B）。小提琴圖顯示（圖5C），SCS評分的中位數(shù)在SCS2中最高，其次是SCS1亞型，而SCS3患者的評分最低。接受者操作特征（ROC）曲線分析進一步表明，SCS評分是區(qū)分SCS2亞型患者的可靠指標(biāo)，診斷準(zhǔn)確率為0.96（圖5D）。通過相關(guān)試驗（圖5E），發(fā)現(xiàn)SCS評分與腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和2型嗜酸細(xì)胞的PCA評分、氟尿嘧啶反應(yīng)的AUC和SIIS值高度正相關(guān)，說明SCS評分是一個能反映腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和2型嗜酸細(xì)胞特征豐富程度的有效指標(biāo)，與氟尿嘧啶耐藥有關(guān)。此外，SCS評分與基質(zhì)途徑和基質(zhì)細(xì)胞特征表達明顯正相關(guān)（圖5F），在dMMR患者中也明顯升高，這與SCS2亞型的結(jié)果一致。

????????接下來，探討了SCS評分在指示結(jié)腸癌患者的預(yù)后和化療獲益方面的作用。首先使用survminer軟件包將患者分為高和低SCS評分組，發(fā)現(xiàn)低SCS評分組的RFS（圖5G，左）和OS（圖5G，右）明顯較高。對SCS評分作為連續(xù)變量的進一步分析顯示，SCS評分是RFS的一個獨立預(yù)后因素。然而，在單變量（圖5H）或多變量分析中，SCS評分和OS之間的明顯相關(guān)性僅存在于接受ADJC的患者亞組。就SCS評分在預(yù)測化療獲益方面的作用而言，作者根據(jù)ROC曲線重新定義了SCS評分的臨界值，以衡量SCS評分在識別SCS2亞型方面的準(zhǔn)確性。只有SCS評分低的患者可以從ADJC中獲益（圖5I）?？傊?，上述結(jié)果顯示，SCS評分是預(yù)測結(jié)腸癌患者預(yù)后和化療效果的有用生物標(biāo)志物，具有良好的臨床轉(zhuǎn)化價值。

圖5 在meta-GEO隊列中構(gòu)建和探索SCS得分

????????為了證實SCS評分的臨床價值和生物學(xué)意義，在TCGA-COAD和SYSUCC隊列中探討了SCS評分的作用。結(jié)果顯示，TCGA-COAD隊列中SCS評分在不同SCS亞型中的分布與meta-GEO隊列中的分布一致（圖6A），在TCGA-COAD隊列中，SCS評分在識別SCS2亞型中患者的AUC值為0.96（圖6B）。此外，與meta-GEO隊列的結(jié)果一致，在TCGA-COAD（圖6C,D）和SYSUCC（圖6E,F）隊列中都觀察到SCS評分與基質(zhì)相關(guān)和炎癥相關(guān)途徑的激活水平呈正相關(guān)；腸內(nèi)分泌細(xì)胞、2型吞咽細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的PCA評分，以及氟尿嘧啶反應(yīng)的AUC值。值得注意的是，在TCGA-COAD隊列中也觀察到MSI-H患者的SCS評分的升高。對TCGA-COAD隊列的進一步生存分析也顯示，較高的SCS評分與較高的死亡率顯著相關(guān)（圖6G）；然而，在ADJC亞組中，SCS評分在單變量（圖6H）和多變量Cox回歸中作為連續(xù)變量都與OS明顯相關(guān)。SCS高分組的患者也無法從ADJC中獲益（圖6I）。這些結(jié)果表明，SCS評分模型有很強的可重復(fù)性。

圖6 在TCGA-COAD和SYSUCC隊列中對SCS評分進行驗證

????????在此，作者使用TIDE算法來預(yù)測對免疫療法有反應(yīng)的可能性。與其他SCS亞型相比，SCS2患者可能更不可能對免疫療法有反應(yīng)，在GSE39582（圖7A，上）和TCGA-COAD隊列（圖7A，下）中的無反應(yīng)率都是最高。一致的是，在GSE39582、TCGA-COAD和SYSUCC隊列中，SCS評分在預(yù)測的免疫療法無反應(yīng)組中明顯上調(diào)（圖7B），并與TIDE評分明顯正相關(guān)（圖7C）。除了TIDE預(yù)測，還使用SubMap將定義的SCS亞型的表達譜與已發(fā)表的包含217名接受抗PD-L1治療的轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌患者治療前轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集進行比較。發(fā)現(xiàn)SCS2亞型的樣本與抗PD-L1無反應(yīng)組的樣本在標(biāo)記基因表達上有明顯的相似性（圖7D），這進一步表明SCS2患者可能不是可以從ICB中獲益的候選人。

圖7 SCS評分與免疫療法益處之間的關(guān)聯(lián)

04 - SCS2亞型樣本中氟尿嘧啶抗性的候選驅(qū)動基因

????????在以前的研究中，作者通過對SW480細(xì)胞進行基于CRISPR的全基因組功能缺失篩選，確定了幾個介導(dǎo)結(jié)腸癌化療耐藥的驅(qū)動基因。為了探討這些驅(qū)動基因是否參與了介導(dǎo)由腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和2型小球細(xì)胞富集引起的氟尿嘧啶抗性，首先分析了GSE39582和TCGA-COAD隊列中SCS2（腸內(nèi)分泌細(xì)胞和2型小球細(xì)胞豐度最高，氟尿嘧啶反應(yīng)率最低）和SCS3（腸內(nèi)分泌細(xì)胞和2型小球細(xì)胞豐度最低，氟尿嘧啶反應(yīng)率最高）之間的DEGs，然后得到DEGs與CRISPR文庫篩選的潛在驅(qū)動基因組的交叉點。結(jié)果確定了七個核心基因，其sgRNA在氟尿嘧啶處理的存活細(xì)胞群中明顯增加，并且在meta-GEO和TCGA-COAD隊列中SCS2亞型的表達明顯增加（圖8A-C）。定義了一個名為CRISPR評分的新變量，其數(shù)值是通過對這七個基因的表達值進行加總而得到的。相關(guān)分析顯示（圖8D-G），CRISPR評分也與GSE39582、TCGA-COAD和SYSUCC隊列中的腸內(nèi)分泌細(xì)胞、亞型2腺細(xì)胞、多種基質(zhì)和骨髓細(xì)胞以及基質(zhì)途徑的PCA評分、氟尿嘧啶反應(yīng)的估計AUC和SCS評分值明顯正相關(guān)。臨床分析進一步表明，在接受ADJC的患者中，CRISPR分?jǐn)?shù)高的患者比CRISPR分?jǐn)?shù)低的患者表現(xiàn)出較差的預(yù)后（CRISPR分?jǐn)?shù)作為一個連續(xù)變量進行分析，圖8H）。同樣，還發(fā)現(xiàn)，ADJC的表現(xiàn)增加了高CRISPR評分亞組的死亡風(fēng)險（圖8I）?？傊?，根據(jù)這些真實世界隊列的分析結(jié)果，認(rèn)為這七個基因可能以高度協(xié)調(diào)的方式驅(qū)動SCS2患者的化療抵抗。

????????由于單純的化療可能無法使腸道內(nèi)分泌細(xì)胞和2型腺細(xì)胞富集水平高的患者受益，作者探討了可用于SCS2亞型患者的化療增敏的潛在化合物。通過分析CTRP數(shù)據(jù)庫中化合物的AUC與GSE39582、TCGA-COAD和SYSUCC隊列中SCS評分之間的相關(guān)性，確定了19個化合物，其與SCS評分的相關(guān)系數(shù)在三個隊列中同時小于-0.5（圖8J）。對這些化合物的基因靶點（圖8K，頂部）和活性（圖8K，底部）的進一步分析表明，有6個是PI3K激酶家族成員的抑制劑。其中，XK765針對多種PI3K催化亞基；TGX-221和AZD6482都能抑制PIK3CB的活性，而AZD6482、CAL-101和TG-100-115主要抑制PIK3CD的活性。這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)SCS2患者有效的化學(xué)增敏治療策略提供了一個新的視角。

圖8 篩選驅(qū)動基因和候選目標(biāo)或化合物

四、結(jié)論

????????該研究全面揭示了與分泌細(xì)胞標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄表達富集有關(guān)的臨床行為、TME和生物學(xué)行為的異質(zhì)性。此外，SCS評分是一個容易獲得的模型，可用于識別SCS2患者，這是一組具有特殊臨床特征的患者。