酶制劑冷凍干燥的挑戰(zhàn):如何鎖住100%活力
生物制品如蛋白質(zhì)、酶和抗體在溶液狀態(tài)下容易受到物理降解（如變性、聚集）和化學(xué)反應(yīng)（如氧化、水解）的影響，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能不穩(wěn)定[1]。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多的生物制品開始采用冷凍干燥技術(shù)（Lyophilization）以延長其保存期限和提高運(yùn)輸便利性。這一方法通過將物質(zhì)中的水分直接從固態(tài)升華成氣態(tài)而去除，從而能夠在不破壞產(chǎn)品結(jié)構(gòu)的情況下，保留樣品原有的生物活性，實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定保存。然而在實(shí)際冷凍干燥過程中，對于酶這類對環(huán)境條件極為敏感的生物活性分子來說，可能會受到多種不利因素的影響，包括低溫應(yīng)力[2]、濃度效應(yīng)[3]、pH 值變化[4]、相分離[5]?和脫水應(yīng)力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的可逆或不可逆變化，從而影響活性。如何確保凍干前后酶活性的有效保持成為了亟待解決的技術(shù)難題之一。此外，即便是在理想的儲存條件下，酶制劑在放置過程中仍面臨著活性逐漸喪失的風(fēng)險(xiǎn)，這不僅影響了產(chǎn)品的最終效果，也增加了生產(chǎn)成本。
影響酶制劑凍干活性與穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素
凍干工藝的關(guān)鍵參數(shù)：解鎖最佳的路徑
冷凍干燥主要包括預(yù)凍、退火、一次干燥和二次干燥等關(guān)鍵階段。精確調(diào)控每個步驟的條件及參數(shù)，對于確保酶制劑在凍干后的生物活性和穩(wěn)定性至關(guān)重要，這其中預(yù)凍階段的凍結(jié)溫度、一次干燥階段的崩解溫度和加熱速率和二次干燥階段的溫度和時間尤為重要。
●?凍干參數(shù)關(guān)鍵點(diǎn)I：凍結(jié)溫度
凍結(jié)溫度決定了冰晶的形成和大小。適當(dāng)?shù)膬鼋Y(jié)溫度可以形成細(xì)小均勻的冰晶，有助于提高升華效率并減少對生物分子結(jié)構(gòu)的損傷。凍結(jié)溫度應(yīng)低于共晶點(diǎn) 10-20℃，以確保所有溶質(zhì)完全固化。
James A 等[6]?通過控制成核溫度和速率，改善了樣品成核時的不均勻性，在提升樣品穩(wěn)定性的同時使初始干燥效率提高了 3.5 倍。
●?凍干參數(shù)關(guān)鍵點(diǎn)II：一次干燥階段的崩解溫度和加熱速率
崩解溫度是干燥層溫度達(dá)到某一臨界值時，固體基質(zhì)的剛性不足以維持蜂窩狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致空穴壁塌陷的溫度。控制干燥溫度低于崩解溫度可以防止結(jié)構(gòu)塌陷，確保升華過程順利進(jìn)行。可采用差示掃描量熱法（DSC）或其他方法測定崩解溫度，并確保一次干燥階段的溫度低于該溫度。下圖為人血白蛋白在凍干過程中，由于溫度升高結(jié)構(gòu)逐漸塌陷的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)[7]。
A：樣品與空氣/液體界面冷凍（1*），B：干燥界面沿著前沿推進(jìn)（2*），C：溫度升高，前沿塌陷（3*）及表面破裂（4*）
加熱速率則影響水分的升華速度和均勻性。過快或不均勻的加熱會導(dǎo)致局部過熱，從而破壞樣品結(jié)構(gòu)。緩慢且均勻的加熱有助于水分均勻升華，避免局部過熱。
●?凍干參數(shù)關(guān)鍵點(diǎn)III：二次干燥階段的溫度時間二次干燥階段用于去除殘留的結(jié)合水，徹底干燥樣品。設(shè)定適當(dāng)?shù)臏囟龋ǜ哂谝淮胃稍餃囟鹊陀跇悠纺褪軠囟龋┖妥銐虻臅r間以徹底去除殘留水分，可以確保樣品完全干燥，同時避免過度干燥導(dǎo)致樣品變性。
制劑配方的魔法：保護(hù)劑如何在凍干工藝中發(fā)揮作用
凍干保護(hù)劑在冷凍干燥過程中發(fā)揮著多重的作用，它們能夠防止物理損傷和化學(xué)降解、保持生物制品（如酶、蛋白質(zhì)和抗體）的穩(wěn)定性和活性，增強(qiáng)樣品的重構(gòu)能力。凍干保護(hù)劑的選擇原則通常包括玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）、水置換能力、保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的能力和增強(qiáng)重構(gòu)等能力，此外根據(jù)具體應(yīng)用場景還需要考慮抗氧化能力、化學(xué)穩(wěn)定性、生物相容性和成本效益等因素。
其中 Tg 是指保護(hù)劑從橡膠態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)的溫度，在冷凍干燥后蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性方面起著至關(guān)重要的作用。選擇具有較高 Tg 的保護(hù)劑，如海藻糖、蔗糖等，可以確保樣品在一次干燥階段保持玻璃態(tài)，防止蛋白質(zhì)在儲存過程中的變性和降解，從而維持結(jié)構(gòu)完整性。
糖類和多羥基化合物是最常見、使用最廣泛的一類凍干保護(hù)劑，其中二糖是最有效的保護(hù)劑，尤其是蔗糖和海藻糖[9]，這是由于它們具有較高的高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）和良好的水置換能力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。Jovanovi? Natasa 等[10]?通過掃描電鏡觀察肌紅蛋白和溶菌酶在凍干過程中的顆粒形態(tài)，發(fā)現(xiàn)未添加保護(hù)劑時顆粒形態(tài)受到凍干應(yīng)力的影響而變化，而蔗糖和海藻糖能夠有效保護(hù)顆粒形態(tài)不受影響。
通過微觀的改變進(jìn)而保持凍干過程酶的活力及穩(wěn)定性，Kawai Kiyoshi 等[11]?將四種二糖作為乳酸脫氫酶的凍干保護(hù)劑，有效減少了乳酸脫氫酶在凍干過程的活力損失，同時提升了在長期儲存的穩(wěn)定性。
酶制劑凍干工藝開發(fā)思路
凍干工藝的開發(fā)是一個系統(tǒng)而復(fù)雜的過程，涉及共晶點(diǎn)測試、崩解溫度測試、升華速率測試、凍干保護(hù)劑篩選等多個步驟，需要綜合關(guān)鍵影響因素的分析，進(jìn)行系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，才能得到良好的凍干工藝。
在瀚海新酶某生化診斷酶原料開發(fā)中，由于溶質(zhì)和樣品混合液的崩解溫度低，且混合液濃度較低，凍干后的產(chǎn)品出現(xiàn)表面塌陷、非一致性分散，無法形成良好的凍干粉餅形態(tài)；更為棘手的是在只含有緩沖劑成分凍干后酶活力和凍干粉 37℃ 熱穩(wěn)孵育過程均出現(xiàn)大幅度下降（配方 1.0）。產(chǎn)品塌陷的問題主要是由于一次干燥溫度高導(dǎo)致，因此降低干燥溫度后可解決，但是想要形成蜂窩結(jié)構(gòu)及保持酶的穩(wěn)定性，則需要進(jìn)行保護(hù)劑的篩選和組合。在初步篩選中，通過評估其對酶活性的保護(hù)效果，獲得了優(yōu)勢的凍干保護(hù)劑：配方 1.5 和配方 1.6；進(jìn)一步將配方1.5 和 1.6 進(jìn)行組合和濃度優(yōu)化，經(jīng)過3輪測試，最終獲得凍干活力高且熱穩(wěn)定性好的最佳配方 3.4。同時通過優(yōu)化一次干燥溫度→保護(hù)劑篩選→凍干緩沖液配方最終得到了良好的凍干外觀。
Step1：由于一次干燥溫度過高，超過崩解溫度，出現(xiàn)產(chǎn)品塌陷的現(xiàn)象。
Step2：優(yōu)化干燥溫度，解決塌陷問題，但產(chǎn)品出現(xiàn)非一致性分散，主要原因是凍干結(jié)構(gòu)剛性差，無法形成良好的蜂窩狀結(jié)構(gòu)。
Step3：通過保護(hù)劑的篩選，改善了凍干形態(tài)，但由于樣品與西林瓶存在高表面張力，出現(xiàn)產(chǎn)品爬壁現(xiàn)象。
Step4：調(diào)整凍干配方，改善溶液表面張力，獲得良好凍干品相的優(yōu)勢工藝。
瀚海新酶凍干產(chǎn)品和凍干開發(fā)平臺
PCR?可凍干試劑
凍干試劑是指將 PCR 反應(yīng)所需的各種組分（包括 DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、MgCl?、緩沖液和引物等）進(jìn)行凍干處理，制備成穩(wěn)定的粉末狀/凍干球制品。加水復(fù)溶后，即可直接進(jìn)行PCR反應(yīng)。與傳統(tǒng)的液態(tài) PCR 試劑相比，凍干試劑穩(wěn)定性強(qiáng)，便攜性、易用性高且可適配自動化設(shè)備，大大拓展了PCR技術(shù)在病原體快速診斷、基因檢測、法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域真實(shí)場景的應(yīng)用范圍。
瀚海新酶提供 MS qPCR/RT-qPCR 可凍干預(yù)混液，支持加引探凍干，后續(xù)使用時直接加入樣本核酸即可；支持單重/多重檢測；使用 UDG-dUTP 防污染體系，能有效防止擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠污染的風(fēng)險(xiǎn)。
LAMP可凍干試劑及定制化服務(wù)
凍干試劑是指將 LAMP反應(yīng)所需的各種組分（包括 Bst 酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、MgCl?、緩沖液和引物等）進(jìn)行凍干處理，制備成穩(wěn)定的粉末狀/凍干球制品。加水復(fù)溶后，即可直接進(jìn)行 LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)。與傳統(tǒng)的液態(tài) LAMP 試劑相比，凍干試劑穩(wěn)定性強(qiáng)，便攜使用便攜，可常溫儲存，大大降低了冷鏈運(yùn)輸成本。
瀚海新酶提供：LAMP/RT-LAMP 可凍干預(yù)混液及凍干產(chǎn)品，也提供定制化的 CRO/CDMO 凍干服務(wù)，針對客戶多樣化需求為客戶定制特殊需求的凍干產(chǎn)品。
凍干校準(zhǔn)質(zhì)控品
瀚海新酶創(chuàng)新性地采用動物源血基質(zhì)來制作糖化血紅蛋白校準(zhǔn)質(zhì)控品，成本低廉且獲取容易，適合大批量生產(chǎn)，有助于工業(yè)化生產(chǎn)；使用者可以一次訂購1年或以上的量，避免頻繁地更換靶值和控圖。在提高血紅蛋白校準(zhǔn)質(zhì)控品的產(chǎn)量的同時，有效地規(guī)避了生物安全問題及進(jìn)出口法規(guī)風(fēng)險(xiǎn)。
凍干CMO服務(wù)
瀚海新酶作為特種酶行業(yè)領(lǐng)先者，擁有豐富的重組蛋白產(chǎn)品開發(fā)和生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，擅長大腸桿菌和酵母菌表達(dá)體系，經(jīng)過長期的項(xiàng)目研發(fā)、核心技術(shù)積累以及產(chǎn)業(yè)化深耕，我們搭建了超凈酶的純化平臺和豐富的凍干制劑開發(fā)技術(shù)，可提供0.4m2-0.5m2-2m2-10m2-20m2不同規(guī)模凍干平臺，可匹配小試-中試-產(chǎn)業(yè)化各個階段的生產(chǎn)需求。
