背景前提：
1：一個(gè)Cluster和剩下的所有細(xì)胞的差異分析，反映的是各個(gè)Cluster的特征；
2：組間差異分析（類(lèi)似經(jīng)典組學(xué)差異比較；需要樣品送齊）

意義：
1：找出每個(gè)聚類(lèi)中的‘“高表達(dá)”的Market基因；與后續(xù)細(xì)胞鑒定中用到的Marker基因不一樣，但是可以作為依據(jù)。
2：組間的差異比較，結(jié)合后續(xù)的KEGG,GO功能富集分析；揭示樣本（組間）功能差異

輸入信息：
seurat_obj ：Seurat對(duì)象
分組信息

part1：篩選cluster中的‘“高表達(dá)”的Market基因：

#FindAllMarkers函數(shù)：保留在目標(biāo)cluster中上調(diào)，且至少在10%的細(xì)胞中表達(dá)的基因。log2-foldchange閾值為0.26
markers_all <- FindAllMarkers(object = seurat_obj, assay = "RNA", slot = "data",
    logfc.threshold = 0.26, test.use = "wilcox", min.pct = 0.1, only.pos = TRUE, verbose = TRUE)

#進(jìn)一步篩選 校正p值≤0.01、“平均log2 fold change”≥0.26的基因
markers_sig <- subset(markers_all, pct.1 >= 0.1 & pct.2 >= 0.1 & p_val_adj <= 0.01 & avg_log2FC >= 0.26)

火山圖、熱圖、柱形圖展示：
分簇火山圖

#火山圖差異顯著標(biāo)識(shí): Q值<0.01
markers_df$color <- factor(ifelse(markers_df$Qvalue < 0.01, "red", "blue"),levels=c('red','blue'))

火山圖

# X軸：pct.1 - pct.2 :
markers_df$xpct <- markers_df$pct.1 - markers_df$pct.2

基因在目標(biāo)簇 vs 其他簇的表達(dá)細(xì)胞百分比差異

熱圖

柱形圖

cluster中差異基因 (top10）的結(jié)果展示：氣泡圖，山脊圖，小提琴圖，聚類(lèi)圖；

氣泡圖

山脊圖

part2：前面是基于cluster的整體維度、后續(xù)介紹了分組差異基因的維度：
組間的差異比較：

# 使用lapply生成所有可能的組間差異組合
vs_comb <- lapply(seq_along(vs),function(x){list(g1=vs[x],g2=vs[-x])})

#核心函數(shù)：FindMarkers
markers <- FindMarkers(seurat_obj,ident.1=comb$g1,ident.2=comb$g2,group.by=group)

 #篩選顯著差異基因(p_val ≤ 0.05)，每個(gè)分組取前3的基因?yàn)閙arker基因
markers_sig <- subset(markers, p_val <= 0.05)
top3_genes <- head(unique(df[order(abs(df$avg_log2FC),decreasing=T),'Gene']),3)

#FeaturePlot 根據(jù)篩選的marker基因繪制umap聚類(lèi)圖
p <- FeaturePlot(seurat_obj[,seurat_obj@meta.data[[group]]%in%vs], features=top3_genes, reduction="umap", split.by=group, alpha=0.5, cols=c("grey", "red"))

top3基因的聚類(lèi)圖