獨(dú)特的環(huán)狀結(jié)構(gòu)讓二代測序較短的讀長限制了對其鑒定以及定量，目前僅僅依靠其反向剪切序列；另外，環(huán)狀RNA的表達(dá)總是與來源基因（host gene）線性RNA的表達(dá)糾纏不清，讓我們很難區(qū)分差異是來源于反向剪切還是只是來源基因的副產(chǎn)物。
對此，許多軟件在識別上下功夫，比如DCC、CIRCexplorer、CIRI等等，然后用DESeq2或edgeR進(jìn)行差異分析；而另一些軟件在定量上使勁，對環(huán)狀 RNA 的定量不僅僅使用反向剪切序列（BSJ），而且考慮到來源基因線性分子表達(dá)的影響，使用BS ratio進(jìn)行定量，例如DCC、CIRI2、CIRIquant以及CLEAR。當(dāng)然這種定量就不適合用于DESeq2或edgeR，一般可以用DCC::CircTest或CIRIquant等軟件進(jìn)行差異分析。
DEBKS介紹
最近北大基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院楊恩策團(tuán)隊提出了環(huán)狀RNA差異分析的新方法DEBKS，對BS ratio進(jìn)行了優(yōu)化（公式及圖解如下）。
對此，DEBKS設(shè)計了4個模塊（見下面的流程圖）
- merge，整合不同樣品的環(huán)狀RNA
- count，對來源基因的線性RNA進(jìn)行定量
- anno，評估環(huán)狀RNA長度
- dec，檢測差異表達(dá)環(huán)狀RNA
以及兩個差異表達(dá)模式
- paired，配對的樣品
- unpaired，非配對的樣品
性能評估
作為一款工具，我們需要首先對其性能進(jìn)行評估。
作者首先用了兩套公共數(shù)據(jù)集檢測了DEBKS識別差異環(huán)狀RNA的檢出率并用RT-qPCR進(jìn)行了驗(yàn)證；隨后，用模擬數(shù)據(jù)對DEBKS以及其他軟件進(jìn)行了評估，評估內(nèi)容包括
- 重復(fù)樣品表達(dá)一致性檢驗(yàn)
- AUC，真陽性率以及假陽性率
- 差異表達(dá)基因檢測敏感性
- 來源基因表達(dá)對差異環(huán)狀RNA的影響
通過比較，DEBKS具有更優(yōu)秀的性能并且更少受來源基因表達(dá)的影響。
局限性
由于需要包含線性剪切位點(diǎn)的表達(dá)（LJC），因此，DEBKS只能應(yīng)用于既包含環(huán)狀 RNA又包含線性RNA的測序，例如rRNA-depleted RNA-seq或exome capture RNA-seq。
另外，基因間區(qū)的環(huán)狀RNA由于缺乏線性分子的表達(dá)，因此無法用DEBKS評估。
結(jié)束語
雖說目前差異分析幾乎被edgeR/DESeq包攬，然而面對復(fù)雜多樣的生物學(xué)情景以及日益增長的多組學(xué)信息，分析工具的多樣性和特異性是非常有必要的。
環(huán)狀RNA研究越發(fā)蓬勃，然而專門的工具卻仍舊匱乏，另外，有些工具走著走著就丟了。雖然DEBKS在文章中提到表現(xiàn)比較優(yōu)秀，然而能不能成為環(huán)狀RNA研究的利刃，仍需要大量真實(shí)數(shù)據(jù)去檢驗(yàn)。
參考資料：
