ilumina公司的二代測序使用的是邊合成邊測序和四色熒光可逆終止反應的方法。
四色熒光可逆終止反應中3’blocked reversible teminator reaction（3‘端可逆終止反應） 的特點是：每個循環(huán)中加入的dNTP的3’端都有疊氮基團修飾，保證每次合成鏈上只加入一個堿基。這個疊氮基團的穩(wěn)定與否，往往會產生兩種錯誤信號，這些錯誤信號就是測序種噪音的來源，如下圖所示：
【陳巍學基因】視頻2：HiSeq工作原理
- 第一種被稱為Phasing，主要因為酶活性不足無法去掉3’端的疊氮基團：在進入下一次循環(huán)后，如果上一個加入的堿基的3’端的疊氮基團未去掉，那么這一次循環(huán)中這個合成鏈就無法延伸，捕捉到的熒光信號還是上一個循環(huán)中的，而不是該位置的；
- 第二種被稱為Prephasing，主要因為疊氮基團在有機化合物中并不穩(wěn)定：在一次循環(huán)中，合成鏈上加入的那個堿基的3‘端無疊氮基團，那么這一次循環(huán)中合成鏈上延伸部分的堿基就會多于1個，那么捕捉到的熒光信號就不是該位置的。
綜上，在圖中正確的熒光信號是藍色，但是由于phasing和prephasing的存在，混有了紅色和黃色的熒光信號，這種信號也被稱為噪音。在每次循環(huán)后進行激光掃描時，正確的信號和噪音都會被掃描到。
在ilumina測序中，一個簇一般有5000～10000個分子。例如，每個簇有5000個分子，那么理想情況下這5000個分子在一次循環(huán)中都只延申一個堿基，但總有一部分分子沒有延申，這樣越到后面這樣的分子越多，信號的可靠性就會越差。一般來說，12個循環(huán)后一般就要考慮phasing和prephasing對信號的影響。
