這篇文章于2023年5月發(fā)表于Cell Metabolism（IF=29，Extracellular vesicles in fatty liver promote a metastatic tumor microenvironment），探討了胞外囊泡對(duì)腫瘤微環(huán)境形成的作用及其機(jī)制，正在進(jìn)行相關(guān)研究或者苦于細(xì)胞間相互作用機(jī)制探索的同學(xué)可以借鑒一下：

研究意義：結(jié)直腸癌（CRC）發(fā)病率位居所有癌癥的第三位，死亡率位居第二。肝臟是CRC轉(zhuǎn)移最常見的器官，其獨(dú)特的代謝和免疫微環(huán)境有利于CRC的肝臟轉(zhuǎn)移。70%的CRC患者會(huì)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，這是CRC致死的主要原因。肥胖和非酒精性脂肪肝（NAFLD）是CRC的重要危險(xiǎn)因素，脂肪肝會(huì)促進(jìn)CRC肝臟轉(zhuǎn)移以及CRC肝轉(zhuǎn)移癌組織切除術(shù)后復(fù)發(fā)。CRC肝轉(zhuǎn)移小鼠內(nèi)，脂肪肝通過改變肝臟炎癥和免疫微環(huán)境促進(jìn)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞生長。因此，發(fā)生癌轉(zhuǎn)移脂肪肝其腫瘤微環(huán)境（TME）的異質(zhì)性可能會(huì)導(dǎo)致不同CRC遷移機(jī)制，這可能解釋不同CRC患者對(duì)治療方式應(yīng)答的差別。這也提示：對(duì)患有脂肪肝的CRC患者，其肝轉(zhuǎn)移的治療需要采取不同策略。所以，闡明患有脂肪肝CRC患者其肝轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制有重要的臨床意義。

? ? ? 胞外囊泡（EVs）含有microRNAs、脂類和蛋白質(zhì)等具有生物活性的物質(zhì)，神經(jīng)酰胺合成通路是調(diào)控其生成和分泌的主要通路（主要由中性鞘磷脂酶和Rab27a/RAB27b等蛋白調(diào)控）。Rab27a可以介導(dǎo)黑色素瘤EVs的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移，對(duì)脂過載引起的EVs分泌至關(guān)重要。NAFLD患者肝細(xì)胞來源的EVs分泌增加，其含有的microRNAs發(fā)生顯著改變。此外，有研究指出，腫瘤來源的EVs可遷移至肝臟并促進(jìn)利于腫瘤細(xì)胞遷移和促遷移炎癥應(yīng)答環(huán)境的形成，但CRC肝轉(zhuǎn)移是否與EVs有關(guān)未知。

? ? ? YAP是轉(zhuǎn)錄輔因子，在未被MST1/2-LATS1/2通路磷酸化時(shí)，YAP入核和促癌轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移相關(guān)基因表達(dá)。此外，G蛋白偶聯(lián)受體和microRNAs也調(diào)控YAP的活性。YAP還通過上調(diào)PD-L1表達(dá)或募集M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（M2-TAMs）及髓系來源抑制細(xì)胞構(gòu)建免疫抑制微環(huán)境，最終促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。但YAP在EVs介導(dǎo)的CRC肝轉(zhuǎn)移的作用及其調(diào)控機(jī)制還未有相關(guān)報(bào)道。

研究策略：研究人員通過CRC和其肝轉(zhuǎn)移的密切關(guān)系確定的研究目的，然后引入EVs介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用來探討肝臟微環(huán)境對(duì)CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的影響作用和機(jī)制。接下來作者特異性的檢測(cè)了EVs的重要內(nèi)容物microRNAs在不同條件下的變化譜并鎖定了發(fā)揮作用的關(guān)鍵microRNAs，并依次進(jìn)行下游靶點(diǎn)的篩選和功能驗(yàn)證，最終在患有脂肪肝的CRC患者的肝轉(zhuǎn)移組織中驗(yàn)證出：肝細(xì)胞分泌EVs→EVs內(nèi)容物microRNAs抑制Lats2表達(dá)→YAP活性增加并入核→直接促進(jìn)CRC腫瘤細(xì)胞生長/通過CYR61構(gòu)建腫瘤抑制微環(huán)境→促腫瘤進(jìn)展這一促腫瘤進(jìn)展的信號(hào)軸。

研究方法：

1、Increased extracellular vesicle release by fatty liver enhances metastatic tumor growth in the liver（確認(rèn)CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞生長和EVs及脂肪肝的關(guān)系）

? ? ? 首先需要確認(rèn)脂肪肝對(duì)CRC的肝轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移后生長有影響。作者給予小鼠高/低脂飲食（HFD/LFD）構(gòu)建脂肪肝小鼠模型，再于脾臟處注射MC38（CRC細(xì)胞系）構(gòu)建CRC肝轉(zhuǎn)移模型。高脂飲食小鼠肝臟腫瘤顯著增大，且小鼠和患者血清EVs數(shù)量顯著增加（圖1A-B）。此外，給予HFD小鼠來源以及患者來源的EVs能顯著促進(jìn)CRC癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（圖1C-E）。用棕櫚酸酯（PA，NAFLD患者最豐富的脂類）處理小鼠原代肝細(xì)胞（PHCs）和Huh7肝癌細(xì)胞系，收集上清里的EVs處理細(xì)胞。PA促進(jìn)PHCs和Huh7細(xì)胞EVs的分泌，而上述來源EVs促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（圖1F-G）。綜上，NAFLD患者肝細(xì)胞分泌的EVs促進(jìn)CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤生長。

圖1

? ? ? Rab27a/b和中性鞘磷脂酶是調(diào)控EVs合成分泌的主要蛋白。HFD飲食小鼠肝臟和NAFLD患者肝臟Rab27a表達(dá)顯著增加（圖2A-B）。敲低Rab27a抑制HFD小鼠CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤生長，但對(duì)LFD小鼠沒有影響（圖2C-D）。相反，過表達(dá)Rab27a促進(jìn)CRC肝轉(zhuǎn)移和生長。綜上，肝細(xì)胞Rab27a高表達(dá)促進(jìn)患脂肪肝的CRC患者的肝轉(zhuǎn)移和生長，這與Rab27a介導(dǎo)的EVs生成有關(guān)。

圖2

2、miRNAs are the functional extracellular vesicle contents that aggravate colorectal cancer growth in fatty liver（確認(rèn)患脂肪肝的CRC患者肝細(xì)胞分泌EVs促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移CRC進(jìn)展的內(nèi)容物）

? ? ? 接下來作者探討了EVs內(nèi)容物對(duì)肝轉(zhuǎn)移CRC細(xì)胞的作用。對(duì)健康/NAFLD患者、LFD/HFD飲食小鼠、LFD/HFD飲食CRC模型小鼠來源血的EVs以及HFD飲食小鼠肝細(xì)胞和PA處理小鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)上清EVs的microRNAs進(jìn)行了分析。miR-103、miR-25和miR-92a顯著上調(diào)（圖3A）。接下來便是對(duì)microRNAs影響CRC細(xì)胞的功能驗(yàn)證。PA處理肝細(xì)胞EVs里miR-103、miR-25和miR-92a表達(dá)增加，癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)microRNAs促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制micrRNAs則緩解癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲（圖3B-F）。綜上，miR-103、miR-25和miR-92a是患有脂肪肝的CRC患者肝細(xì)胞分泌的EVs促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌生長的重要調(diào)控因子。

圖3

3、EVs containing miRNAs regulate pro-tumorigenic YAP signaling in colorectal cancer cells（尋找內(nèi)容物下游）

? ? ? 接下來作者嘗試找到上述microRNAs調(diào)控的直接靶點(diǎn)。通過同時(shí)使用多種生物信息學(xué)預(yù)測(cè)工具，作者發(fā)現(xiàn)Lats2（YAP經(jīng)典上游）表達(dá)顯著下調(diào)（圖4A-B）。過表達(dá)microRNAs促進(jìn)YAP入核（圖4C）。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)表明，microRNAs通過與Lats2的3’UTR區(qū)結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄（圖4D）。PA處理肝細(xì)胞來源的EVs降低Lats2表達(dá)并促進(jìn)YAP核定位，抑制microRNAs則逆轉(zhuǎn)上述改變（圖4E-F）。綜上，miR-103、miR-25和miR-92a通過直接抑制Lats2表達(dá)激活YAP，促進(jìn)CRC進(jìn)展。

圖4

4、YAP activity is increased in colorectal cancer liver metastasis enhanced by non-alcoholic fatty liver disease

? ? ? RNA-seq結(jié)果表明，HFD飲食小鼠腫瘤細(xì)胞YAP和癌癥進(jìn)展相關(guān)基因顯著富集（圖5A）。HFD飲食CRC小鼠其轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞YAP核定位、YAP表達(dá)和下游靶基因表達(dá)顯著增加，但上游抑制分子Lats2表達(dá)顯著下調(diào)（圖5B-D）。敲低HFD飲食CRC小鼠肝細(xì)胞Rab27a恢復(fù)肝轉(zhuǎn)移腫瘤Lats2表達(dá)、YAP的核定位以及靶基因表達(dá)（圖5E）。因此，患有脂肪肝的CRC患者肝細(xì)胞分泌的EVs通過上調(diào)YAP活性促進(jìn)肝轉(zhuǎn)移腫瘤進(jìn)展。

圖5

5、YAP signaling promotes metastatic tumor growth and an immunosuppressive environment in fatty liver

? ? ? 接下來作者進(jìn)一步探討了YAP在脂肪肝肝細(xì)胞EVs促肝轉(zhuǎn)移CRC進(jìn)展的作用機(jī)制。敲低腫瘤細(xì)胞Yap1抑制PA處理肝細(xì)胞分泌EVs對(duì)CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的促進(jìn)作用（圖6A）。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低癌細(xì)胞Yap1顯著抑制腫瘤生長和相關(guān)促腫瘤進(jìn)展信號(hào)通路（圖6B-C）。脂肪肝可通過促進(jìn)M2-TAM浸潤形成免疫抑制微環(huán)境，而敲低腫瘤細(xì)胞Yap1則抑制脂肪肝引起的M2-TAM浸潤（圖6D）。肝臟巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移，而敲低腫瘤細(xì)胞Yap1則抑制肝臟腫瘤細(xì)胞遷移（圖6E）。此外，上述共培養(yǎng)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2極化，而敲低Yap1抑制極化作用（圖6F）。因此，YAP既促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，又間接調(diào)控癌細(xì)胞TME。

圖6

? ? ? 接下來作者想找到Y(jié)AP調(diào)控腫瘤細(xì)胞TME的下游分子。在眾多YAP下游分子里，Ccn1編碼的CYR61是分泌型的趨化因子，其在CRC的表達(dá)隨YAP敲低而降低（圖7A）。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低腫瘤細(xì)胞的Ccn1能抑制共培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的遷移和M2極化（圖7B-C）。因此，YAP通過調(diào)節(jié)CYR61的表達(dá)和分泌介導(dǎo)TME。此外，作者還利用單細(xì)胞RNA-seq對(duì)腫瘤細(xì)胞周圍的免疫細(xì)胞進(jìn)行了分析。他們?cè)诟咧嬍承∈竽[瘤組織找到了2個(gè)M1 TAM亞群 、4個(gè)M2 TAM亞群和2個(gè)CD8+T細(xì)胞亞群，且M2亞群均屬于NAFLD疾病里支持腫瘤生長的巨噬細(xì)胞亞型（圖7D-E）。

圖7

6、Increased YAP activity and an immunosuppressive tumor microenvironment in patients with colorectal cancer liver metastasis and non-alcoholic fatty liver disease

? ? ? 最后，作者用患有脂肪肝的CRC病人樣本對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行了確認(rèn)?；加兄靖蔚腃RC病人其腫瘤組織YAP核定位、CYR61表達(dá)和腫瘤組織M2-TAM的浸潤顯著增加（圖8A-B）。質(zhì)譜流式技術(shù)（Imaging mass cytometry，IMC）結(jié)果顯示，患有脂肪肝的CRC患者M(jìn)2-TAM和CD8+T細(xì)胞顯著增加（圖8C-D）?；加兄靖蔚腃RC病人原發(fā)病灶腫瘤組織YAP和Ki67表達(dá)較沒有脂肪肝的CRC病人原發(fā)病灶高，而轉(zhuǎn)移腫瘤組織YAP和Ki67表達(dá)比原發(fā)病灶高（圖8E）。對(duì)細(xì)胞間距離進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，M2-TAM更接近YAP陽性的腫瘤細(xì)胞，而CD8+T細(xì)胞則相反（圖8F）。患者樣本檢測(cè)結(jié)果表明，脂肪肝影響CRC肝臟轉(zhuǎn)移腫瘤組織的YAP表達(dá)、腫瘤細(xì)胞生長以及其周圍免疫細(xì)胞的功能和分布。

圖8

Take-home message：

? ? ? 這個(gè)故事結(jié)合臨床“CRC患者普遍會(huì)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移”，以及脂肪肝會(huì)促進(jìn)CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤進(jìn)展和復(fù)發(fā)的臨床現(xiàn)象，提出“脂肪肝影響CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤進(jìn)展機(jī)制”。這里他們利用EVs這一可以在細(xì)胞間遞送具有生物活性分子繼而介導(dǎo)彼此間作用的特殊結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。他們發(fā)現(xiàn)EVs的確介導(dǎo)了脂肪肝肝細(xì)胞對(duì)CRC肝轉(zhuǎn)移腫瘤的促進(jìn)作用。此外，在探討可能作用機(jī)制的時(shí)候，直接錨定在了microRNAs，后續(xù)也的確找到了有效應(yīng)的三條microRNAs。然后他們以microRNAs為突破口，接下來就是一系列下游靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和相應(yīng)功能的驗(yàn)證?？傮w而言，這個(gè)故事臨床意義較大，為CRC的肝臟轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供了新的治療方向和靶點(diǎn)，機(jī)制層面EVs到Y(jié)AP調(diào)控腫瘤細(xì)胞的免疫微環(huán)境的驗(yàn)證也較完整。但具體患有脂肪肝的CRC患者其EVs分泌為什么增加（Rab27a表達(dá)調(diào)控上游），以及腫瘤細(xì)胞CYR61介導(dǎo)免疫抑制微環(huán)境形成的具體分子機(jī)制是沒有闡明的問題。YAP促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和分化已有很多相關(guān)報(bào)道，可能這是作者后面提出YAP可以調(diào)控局部微環(huán)境的原因（增加新穎性）。此外，YAP的上游LATS2表達(dá)固然重要，但考慮到其活性受磷酸化調(diào)控，僅僅檢測(cè)其表達(dá)說服力不足。

? ? ? 做一個(gè)好課題，運(yùn)氣是非常重要的。就這篇文章而言，沒有前期的研究做鋪墊，突然提出“EVs影響肝轉(zhuǎn)移腫瘤進(jìn)展”以及“EVs內(nèi)的microRNAs是影響EVs作用的主要分子”這種假說，恰好表明科研有時(shí)候是沒有邏輯的?？蒲杏袝r(shí)候就和投資一樣：風(fēng)險(xiǎn)越大，收益越大。如果做科研的路上沒有思路和想法，不妨跳出固有的思維邏輯，冒險(xiǎn)嘗試一些不同的想法，可能會(huì)別有一番天地。