全基因組分析造血細(xì)胞中的DNA甲基化：WGBS的DNA甲基化分析

First Online: 23 July 2017

譯者注意：文章感覺什么都沒說，也就是講一下背景，測(cè)序中的步驟，可以了解一下，中間經(jīng)過了什么處理。

介紹

DNA甲基化是一種經(jīng)過充分研究，可遺傳和可逆的表觀遺傳修飾，對(duì)多種細(xì)胞過程至關(guān)重要。具體地，DNA甲基化通過酶促機(jī)制實(shí)現(xiàn)，其中甲基被添加到胞嘧啶的五個(gè)位置，通常在CpG二核苷酸的情況下（圖1a）。 CpG幾乎總是甲基化，除非CpG處于高密度時(shí)，在這種情況下甲基化傾向于更低或完全不存在。雖然甲基化模式在細(xì)胞類型中相當(dāng)穩(wěn)定，但基因組的一些區(qū)域（例如增強(qiáng)子）在不同細(xì)胞和組織類型之間的甲基化水平是可變的。異常的DNA甲基化模式與許多人類疾病相關(guān)，例如癌癥和神經(jīng)發(fā)育疾病。雖然啟動(dòng)子和增強(qiáng)子中的DNA甲基化通常與基因表達(dá)的抑制相關(guān)，但基因體中的DNA甲基化與活性轉(zhuǎn)錄正相關(guān)。全面的全基因組DNA甲基化圖譜可以揭示DNA在正常發(fā)育和疾病中的作用。因此，DNA甲基化的全基因組作圖對(duì)于表觀遺傳學(xué)研究具有重要意義。

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圖。1:（a）通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶將胞嘧啶甲基化為5-甲基胞嘧啶。 （b）通過亞硫酸氫鈉轉(zhuǎn)化使胞嘧啶脫氨基。 未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶。 （c）亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和PCR擴(kuò)增后的DNA序列。 未甲基化的胞嘧啶將被檢測(cè)為胸腺嘧啶

DNA甲基化：
    mc --- C
    C  --- T

? 高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了DNA甲基化的全基因組測(cè)量。 目前，有三種主要測(cè)定類型的方法用于研究DNA甲基化[1]。 基于亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的方法，如全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序（WGBS）[2,3]和還原代表亞硫酸氫鹽測(cè)序，（RRBS）是目前最標(biāo)準(zhǔn)的方法[4,5]，但甲基化arrays 和親和捕獲方法是 也用于測(cè)定甲基化差異，特別是在人類細(xì)胞中。

? 在亞硫酸氫鹽測(cè)序方法中，亞硫酸氫鈉用于將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（圖1b），然后在隨后的PCR和測(cè)序中將其檢測(cè)為胸腺嘧啶[6]。 相反，甲基化胞嘧啶和羥甲基化胞嘧啶未經(jīng)修飾而在DNA測(cè)序過程中被鑒定為胞嘧啶（圖1c）。 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化方法已成為以單核苷酸分辨率檢測(cè)全基因組DNA甲基化差異的非常有效的方法。

? 基于親和捕獲的方法，如甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序（MeDIP-seq）[7,8]和羥甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序（hMeDIP-seq）[9]，分別使用識(shí)別甲基胞嘧啶和羥甲基胞嘧啶的抗體來降低甲基化 和羥甲基化的基因組區(qū)域。 Cytosine 5-亞甲基磺酸鹽測(cè)序（CMS-seq）利用硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和親和捕獲方法進(jìn)行5hmC檢測(cè)[10]使用CMS特異性抗血清。 最后一種方法利用基于富集的方法，如甲基化敏感的限制酶消化測(cè)序（MRE-seq）[11]。

WGBS/RRBS
甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序（MeDIP-seq）、羥甲基化DNA免疫沉淀測(cè)序（hMeDIP-seq）
甲基化芯片

Cytosine 5-亞甲基磺酸鹽測(cè)序（CMS-seq）
甲基化敏感的限制酶消化測(cè)序（MRE-seq）

? 雖然我們將重點(diǎn)放在樣品制備上（圖2），但也應(yīng)考慮測(cè)序深度，因?yàn)檫@是該過程總成本的重要因素。 我們建議最低平均覆蓋率為10-15倍。 這轉(zhuǎn)換為使用當(dāng)前Illumina HiSeq protocols的大約2億次讀取。 然而，更高的覆蓋率可以獲得更好的分辨率和檢測(cè)次要甲基化差異的能力。

最低平均覆蓋率為10-15倍
大約2億次讀取

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圖2：WGBS protocol 概述。 分離的基因組DNA被片段化，平均大小為350bp。 將3'和5'突出端修復(fù)成鈍端，并在鈍片段的3'末端添加單個(gè)“A”。 A尾加工后，將甲基化的adapters連接到A尾片段上，并用亞硫酸氫鈉處理。 進(jìn)行最終擴(kuò)增PCR并檢查文庫質(zhì)量。

? 最后，發(fā)現(xiàn)5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）作為一種具有5mC潛在不同性質(zhì)的DNA甲基化，增加了對(duì)該標(biāo)記檢測(cè)的興趣。 重要的是，亞硫酸氫鹽測(cè)序方法不能區(qū)分5mC和5hmC，因?yàn)橛萌我粯?biāo)記修飾的胞嘧啶都不受亞硫酸氫鹽的影響。 因此，生物信息學(xué)分析和解釋必須考慮到這一點(diǎn)。 如果需要，可以使用替代方法如氧化亞硫酸氫鹽測(cè)序（OxBS-seq）[12]或Tet輔助亞硫酸氫鹽測(cè)序（TAB-seq）[13]來檢測(cè)5hmC。

5hmc：羥甲基化（5-羥甲基胞嘧啶（5hmC））
5mC：

# 背景
亞硫酸氫鹽測(cè)序方法不能區(qū)分5mC和5hmC，因?yàn)橛萌我粯?biāo)記修飾的胞嘧啶都不受亞硫酸氫鹽的影響。

# 檢測(cè)5hmc方法：
氧化亞硫酸氫鹽測(cè)序（OxBS-seq）或Tet輔助亞硫酸氫鹽測(cè)序（TAB-seq）

2 Materials

2.1 Reagents

1. PureLink Genomic DNA Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
2. Quant-iT dsDNA Assay Kit, high sensitive (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
3. Snap-Cap MicroTUBE vials (Covaris, Woburn, MA, USA).
4. 4–20% Criterion? TBE Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
5. Low-binding DNAse-/RNAse-free microtubes (Ambion, Waltham, MA, USA).
6. TBE buffer, 10×, Molecular Biology Grade (Promega, Madison, WI, USA).
7. Sybr Gold (Invitrogen, Waltham, MA, USA).
8. TruSeq Nano DNA Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA).
9. EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen, Hilden, Germany).
10. AMPure XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).
11. PfuTurbo Cx hotstart DNA polymerase (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
12. 100 mM dNTP mix (25 mM of each dNTP; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).
13. EvaGreen (Biotium, Fremont, CA, USA).
14. 100% ethanol.
15. 10× PBS (GenDepot, Katy, TX, USA).
16. Ultrapure DNAse-/RNAse-free water (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA)
17. 100 bp DNA Ladder (GenDepot, Katy, TX, USA).
18. 6× DNA loading dye (Promega, Madison, WI, USA).
19. High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Santa Clara, CA, USA).

2.2 Equipment

1. Covaris S2 system (Covaris, Woburn, MA, USA).
2. MicroTube holder (Covaris, Woburn, MA, USA).
3. Dark Reader transilluminator (Clare Chemical Research, Dolores, CO, USA).
4. Qubitfluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
5. DynaMag-2 magnet (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
6. Bio-Rad Thermal cycler (Bio-Rad, CFX96 Touch, Hercules, CA, USA).
7. Real-time PCR cycler (Bio-Rad, C1000, Hercules, CA, USA).
8. Criterion cell system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
9. Heat blocks.
10. Vortex mixer.
11. Bioanalyzer (Santa Clara, CA, USA).
12. Illumina HiSeq 2500 (San Diego, CA, USA).

3方法

3.1基因組DNA分離

3.2 DNA片段化和清除片段化DNA

3.3末端修復(fù)，Poly-a尾和接頭連接（Illumina Nano DNA樣品制備試劑盒）

1. 在最高60μL體積中使用100 ng-1μg片段化DNA。添加重懸浮緩沖液使總體積達(dá)到60μL。

2. 加入40μL末端修復(fù)混合物，總體積為100μL，通過移液整個(gè)體積10次混勻，并全速離心30秒。

3. 在30°C孵育30分鐘，然后將樣品置于冰上（見注6）。

4. 從試劑盒中渦旋樣品純化珠粒以確保均勻分布。使用前將珠子溫?zé)嶂潦覝亍?/p>

5. 在65μL無核酸酶水中稀釋95μL樣品純化珠。

6. 將160μL稀釋的樣品純化珠加入末端修復(fù)反應(yīng)混合物中。移取整個(gè)體積十次并在室溫下孵育5分鐘。

7. 將管放在磁力架上5分鐘。

8. 將250μL含有目標(biāo)DNA的上清液從每個(gè)管中轉(zhuǎn)移到新的PCR管中。丟棄含有珠子的管子。

9. 渦旋樣品純化珠至少1分鐘。將30μL室溫未稀釋的樣品純化珠加入含有250μL上清液的每個(gè)樣品中。移取整個(gè)體積十次。

10. 在室溫下孵育5分鐘。

11. 將樣品置于室溫下的磁架上5分鐘或直至液體澄清。

12. 小心地從管中取出并丟棄所有上清液，不要打擾珠子。

13. 在磁架上放置管子，用200μL新制的80％EtOH沖洗兩次。

14. 將磁珠顆粒在磁力架上風(fēng)干5分鐘。

15. 用20μL重懸浮緩沖液重懸珠子，并通過移液整個(gè)體積十次充分混合。在室溫下孵育2分鐘。

16. 將管放在磁架上5分鐘。

17. 將17.5μL澄清的上清液轉(zhuǎn)移到新的PCR管中。

18. 將12.5μLA尾加入混合物加入到17.5μL上清液中，并將整個(gè)體積的反應(yīng)混合物移液十次。

19. 在37°C孵育30分鐘，在70°C孵育5分鐘，并保持在4°C（見注7）。

20. 當(dāng)熱循環(huán)儀溫度在4°C下保持5分鐘時(shí)，從中取出管子。短暫離心并保持在冰上然后進(jìn)行下一個(gè)連接步驟。

21. 向反應(yīng)混合物中加入2.5μL重懸浮緩沖液，2.5μL連接混合物和2.5μLDNA銜接子指數(shù)。

22. 移取整個(gè)體積十次并短暫離心。

23. 在30°C孵育10分鐘，然后置于冰上。

24. 向混合物中加入5μL終止連接緩沖液并用移液管混合。

25. 加入42.5μL充分混合的樣品純化珠，移液10次，在室溫下孵育5分鐘。

26. 將管放在磁架上5分鐘。

27. 小心取出并丟棄80μL上清液，不要打擾珠子。

28. 用200μL新鮮制備的80％乙醇洗滌珠子兩次。在室溫下風(fēng)干5分鐘。

29. 從磁架上取下管子，通過移液十次將珠子重新懸浮在52.5μL的重懸浮緩沖液中。在室溫下孵育2分鐘。

30. 在室溫下將管放在磁架上5分鐘。

31. 將50μL上清液轉(zhuǎn)移到新的PCR管中。

32. 加入50μL充分混合的樣品純化珠，移液10次，在室溫下孵育5分鐘。

33. 小心取出并丟棄100μL上清液，不要打擾珠子。

34. 用200μL新鮮制備的80％乙醇洗滌珠子兩次。在室溫下風(fēng)干5分鐘。

35. 從磁架上取下管子，通過移液十次將珠子重新懸浮在27.5μL重懸浮緩沖液中。在室溫下孵育2分鐘。

36. 在室溫下將管放在磁架上5分鐘。

37. 將25μL上清液轉(zhuǎn)移到新的PCR管中。

38. 繼續(xù)進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化。

3.4亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化

1. 根據(jù)制造商的建議（EpiTect Bisulfite Kit，Qiagen）設(shè)置亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化率。
   亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化反應(yīng)混合物：
2. 根據(jù)制造商的建議進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，以避免模板降解和處理和凈化過程中的DNA損失，同時(shí)實(shí)現(xiàn)DNA的高亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化率。 連續(xù)兩輪亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化有助于達(dá)到≥99％的轉(zhuǎn)化率。
3. PCR conditions.
4. ......

3.5 3.5文庫PCR擴(kuò)增和珠子純化

Library PCR Amplification and Bead Purification

1. 準(zhǔn)備PCRmix
2. 在實(shí)時(shí)PCR循環(huán)中擴(kuò)增反應(yīng)。
3. 為了最小化PCR引起的偏差，監(jiān)測(cè)擴(kuò)增循環(huán)。 最佳PCR循環(huán)是擴(kuò)增曲線的線性相的中點(diǎn)。 紅線標(biāo)記擴(kuò)增曲線的線性相位的中點(diǎn)，并用于確定最佳擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（圖3a，見注11）。

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圖3：WGBS庫QC。 （a）用熒光染料EvaGreen進(jìn)行最終PCR擴(kuò)增的實(shí)時(shí)分析實(shí)例。 使用CFX96 Touch實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)（Bio-Rad）獲得結(jié)果。 （b）在生物分析儀（安捷倫）上分析的最終文庫的大小分布示例

4. PCR完成后，將每個(gè)反應(yīng)組合并使用1×AMPure XP珠純化PCR產(chǎn)物。

5. 洗去20μL重懸浮緩沖液。

3.6 Library Quality Control

1. 使用Qubit熒光計(jì)量化文庫。 預(yù)期的DNA濃度為10-30 ng /μL。
2. 使用Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit運(yùn)行1μL最終文庫，檢查文庫大小分布。 預(yù)期的平均分布大小為300-500 bp（圖3b）。

4 注意

11.與其他方法相比，WGBS方法準(zhǔn)確且可重復(fù)。偏差和測(cè)量誤差的主要來源于不完全的亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和序列的甲基化與非甲基化形式的差異PCR效率。

等等