要進(jìn)行shRNA載體構(gòu)建，首先需要根據(jù)自己的基因，設(shè)計(jì)出對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)、loop序列，酶切位點(diǎn)序列，詳見LncRNA的shRNA慢病毒載體引物設(shè)計(jì) - 簡(jiǎn)書

一.引物退火

引物先用10000g在4°離心2min，再按照說(shuō)明書的要求，加入DEPC或者無(wú)酶ddH2O將寡核苷酸稀釋為100 μM。

按以下體系配制退火反應(yīng)體系：

無(wú)酶ddH2O補(bǔ)足 20 μl

正義寡核苷酸（100 μM） 2μl

反義寡核苷酸（100 μM） 2μl

10X T4 DNA連接酶緩沖液 1μl (這一步驟可選，也可不加，直接加無(wú)酶ddH2O)

一般來(lái)說(shuō)，把小體積液體往大體積液體中加，相對(duì)會(huì)更準(zhǔn)確，所以答主一般先加ddH2O。

退火反應(yīng)程序：注意需要緩慢退火

1.PCR法：將配制好的退火反應(yīng)緩沖液重復(fù)混合，瞬時(shí)離心后放置在PCR儀上，先95℃ 4min，再70℃ 10min，然后在數(shù)小時(shí)內(nèi)緩慢冷卻至室溫。運(yùn)行以下程序：95℃ 4min，70℃ 10min，55℃ 10min，40℃ 10min，25℃ 10min，10℃ 10min，4℃ ∞。

2.沸水燒杯法：把tube放在在PCR儀或沸水燒杯中95°C孵育4分鐘，4min后將燒杯從火焰中取出，并讓水自然冷卻至室溫。

二.骨架載體酶切+膠回收

酶切體系：（這里用的是NEB的酶和buffer）

①無(wú)酶ddH2O 或DEPC：補(bǔ)足至30uL

②plasmid：體積=5ug/質(zhì)粒濃度

③10X cutsmart：3uL

④限制性內(nèi)切酶1：2uL

⑤限制性內(nèi)切酶2：2uL

膠回收：

本組用的是Omega gel extraction mini kit，E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit (V-spin) | Omega Bio-tek，超詳細(xì)步驟可見過表達(dá)載體合成步驟 - 簡(jiǎn)書。

膠回收可以很大程度上避免DNA連接時(shí)發(fā)生載體自連的情況！

三.DNA連接+轉(zhuǎn)化

DNA連接體系：

雙鏈DNA寡核苷酸：5uL

骨架plasmid：150~200ng/膠回收后的plasmid濃度

T4 DNA連接酶：2uL

T4 DNA連接酶buffer：2uL

ddH2O補(bǔ)足至20uL

16℃連接，過夜or 4小時(shí)均可

質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：

取連接產(chǎn)物與30ul 感受態(tài)細(xì)菌（對(duì)于慢病毒載體，最好選擇stable3菌株，更有利于質(zhì)粒穩(wěn)定；而對(duì)于原核表達(dá)的載體，最好選擇Rosetta菌株）混勻后冰浴30min，42℃熱激90s，立即置冰上放置5min,加入預(yù)熱至室溫的700ul LB培養(yǎng)基， 37℃恒溫培養(yǎng)30min，吸取 200ul的菌液，用移液器混勻后均勻涂布于含50ug/ml Ampicillin抗性（根據(jù)骨架載體的特征來(lái)選，這里用的是pKLO.1質(zhì)粒，因此選Amp）的LB平板上， 37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過夜。

四.驗(yàn)證

1.在LB平板上挑出4~6個(gè)單克隆，加入LB培養(yǎng)基及篩選抗生素，37℃shake ，做質(zhì)粒抽提。

2.測(cè)序驗(yàn)證

由于shRNA載體中的片段較小，一般只有幾十個(gè)bp，因此，若要做雙酶切驗(yàn)證，很可能看不到條帶，直接做測(cè)序。