近日，南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院田博聞博士等為第一作者，廣州市婦女兒童醫(yī)療中心Chaoting Lan、夏慧敏教授、鐘微教授為共同通訊作者在《Inflammation》期刊發(fā)表了題為《Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers》的科研成果，研究通過多組學(xué)分析鑒定出壞死性小腸結(jié)腸炎（Necrotizing Enterocolitis, NEC）腸道組織中的新型甲基化調(diào)控生物標(biāo)志物。研究首先分析了NEC患者回腸和結(jié)腸組織的DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，鑒定出多個甲基化相關(guān)差異基因（Methylation-Related Differentially Expressed Genes, MrDEGs），并通過單細(xì)胞數(shù)據(jù)和靶基因甲基化測序（Targeted Bisulfite Sequencing, TBS）技術(shù)驗(yàn)證這些基因在NEC中的潛在診斷價值。

標(biāo)題：Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis: Unraveling Methylation-Regulated

Biomarkers（壞死性小腸結(jié)腸炎的表觀遺傳學(xué)見解：揭示甲基化調(diào)控的生物標(biāo)志物）

發(fā)表時間：2025年2月

發(fā)表期刊：Inflammation

影響因子：IF5/Q2

技術(shù)平臺：靶基因甲基化測序（TBS）

壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）是一種多因素引起的胃腸道疾病，在早產(chǎn)兒中具有較高的發(fā)病率和死亡率。本研究旨在通過多組學(xué)分析，鑒定出NEC腸道組織中的新型甲基化調(diào)控生物標(biāo)志物。研究首先分析了NEC患者回腸和結(jié)腸組織的DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，揭示了啟動子區(qū)域的甲基化水平與轉(zhuǎn)錄水平呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)而鑒定出甲基化相關(guān)差異基因（MrDEGs），這些基因包括ADAP1、GUCA2A、BCL2L14、FUT3、MISP、USH1C、ITGA3、UNC93A和IL22RA1。單細(xì)胞數(shù)據(jù)顯示，這些MrDEGs主要位于腸道組織的腸道上皮區(qū)域。通過靶基因甲基化測序（TBS）和實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）驗(yàn)證這些MrDEGs，研究人員成功鑒定并驗(yàn)證了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP基因主要在腸道上皮絨毛細(xì)胞中表達(dá)。通過基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）揭示這些基因主要參與NEC中T細(xì)胞分化和抑制腸道炎癥的病理過程。本研究加深了對NEC發(fā)病機(jī)制的理解，并可能推動NEC預(yù)測和診斷新的精準(zhǔn)醫(yī)療方法發(fā)展。

研究方法

樣本收集：共收集16份腸道組織樣本，包括8份NEC患者的回腸組織樣本和8份對照組樣本。

數(shù)據(jù)來源：從GEO數(shù)據(jù)庫中收集NEC的基因表達(dá)和DNA甲基化數(shù)據(jù)集，包括GSE212913（回腸）、GSE212997（結(jié)腸）和GSE46619（結(jié)腸和回腸）。單細(xì)胞數(shù)據(jù)來自Adi Egozi團(tuán)隊研究。

DNA甲基化數(shù)據(jù)分析：差異甲基化區(qū)域（DMRs）分析，并通過UCSC數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因組注釋。

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析：篩選差異表達(dá)基因（DEGs），并進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）。

單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析：單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析，過濾低質(zhì)量細(xì)胞-基因，并進(jìn)行UMAP降維分群。

免疫浸潤分析：分析免疫細(xì)胞浸潤情況。

靶基因甲基化測序（TBS）：對NEC患者和對照組回腸組織樣本進(jìn)行TBS驗(yàn)證，檢測靶基因甲基化水平。

RT-qPCR：驗(yàn)證靶基因的RNA表達(dá)水平。

免疫熒光染色分析：檢測NEC和對照組腸道組織中IL22RA1基因的表達(dá)差異。

圖1：本研究分析流程

結(jié)果圖形

（1）結(jié)腸和回腸NEC病變中的DNA甲基化特征

研究發(fā)現(xiàn)，NEC患者的結(jié)腸和回腸組織中普遍存在高甲基化現(xiàn)象。在回腸中，共有357個區(qū)域的甲基化水平發(fā)生變化，其中262個區(qū)域甲基化水平增加，95個區(qū)域甲基化水平降低。結(jié)腸中甲基化水平變化的區(qū)域有1550個，其中994個區(qū)域甲基化水平增加，556個區(qū)域甲基化水平降低。甲基化區(qū)域主要位于啟動子區(qū)域，結(jié)腸中啟動子區(qū)域甲基化比例為45%（702/1550），回腸中為34.35%（123/357）。這些結(jié)果表明，NEC組織的高甲基化可能通過沉默下游基因表達(dá)介導(dǎo)疾病發(fā)生發(fā)展。

圖2：GSE212997和GSE212913數(shù)據(jù)集中的人NEC中差異甲基化區(qū)域及GSE46619 數(shù)據(jù)集中人NEC 中差異表達(dá)基因。 a-b. 人NEC組和對照組（CTRL）樣本中DMRs散點(diǎn)圖。橫軸表示NEC和CTRL的平均甲基化水平，縱軸表示兩組甲基化水平差異。紅色點(diǎn)代表顯著上調(diào)的區(qū)域，藍(lán)色點(diǎn)表示顯著下調(diào)的區(qū)域。 c-d. 不同區(qū)域（啟動子、外顯子、內(nèi)含子、基因間區(qū)、3’UTR 和遠(yuǎn)端基因間區(qū)）DMRs 比例扇形圖。 e.? 與NEC標(biāo)志基因相關(guān)DEGs火山圖。 f.?? DEGs 的GSEA分析。 g.? 免疫浸潤分析預(yù)測免疫細(xì)胞比例箱線圖?？v軸表示免疫細(xì)胞的富集水平，橫軸表示每種免疫細(xì)胞名稱。

（2）NEC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的免疫學(xué)特征

通過對GSE46619轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集分析，揭示了NEC樣本中共有1,693個差異表達(dá)基因（DEGs），其中499個上調(diào)基因和1,194個下調(diào)基因。這些基因包括已知的NEC標(biāo)志基因，如TLR4、CXCL8、PLA2G7、HBEGF和FABP2。通過GSEA分析揭示了與NEC相關(guān)的基因集主要參與免疫炎癥通路，如NF-κB信號通路、IL-17信號通路和TNF信號通路。免疫浸潤分析顯示，NEC組中激活的樹突狀細(xì)胞、效應(yīng)記憶CD4+T細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞（immature dendritic cells）、巨噬細(xì)胞（macrophages）、肥大細(xì)胞（mast cells）、髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)、NKT細(xì)胞(Natural killer T cell)、中性粒細(xì)胞（neutrophils,）、漿細(xì)胞樹突狀細(xì)胞（plasmacytoid dendritic cells）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、T濾泡輔助細(xì)胞、Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞數(shù)量與對照組存在顯著差異（圖2g）。這些結(jié)果表明，免疫細(xì)胞過度激活在NEC的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

（3）NEC中MrDEG的多組學(xué)聯(lián)合分析

研究通過結(jié)合DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果篩選出9個甲基化調(diào)控基因，包括ADAP1、GUCA2A、BCL2L14、FUT3、MISP、USH1C、ITGA3、IL22RA1和UNC93A。這些基因在NEC組織中DNA甲基化水平升高和RNA表達(dá)水平降低。單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析顯示，這些基因主要在腸道上皮細(xì)胞中表達(dá)，尤其是腸絨毛細(xì)胞。通過靶基因甲基化測序（TBS）和RT-qPCR驗(yàn)證，驗(yàn)證了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP這4個基因的甲基化水平與RNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，表明其可能是NEC的潛在生物標(biāo)志物。

圖3：篩選甲基化相關(guān)差異基因（MrDEGs）并分析其在NEC單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中的定位。 a.? ?不同腸道部位甲基化相關(guān)基因上調(diào)或下調(diào)基因UpSet圖。 b-c. ADAP1/GUCA2A的甲基化區(qū)域比對到到基因組上的UCSC基因組瀏覽器圖。黑色區(qū)域表示高甲基化位置，條形圖顯示NEC組與對照組的平均甲基化水平。 d. ??按細(xì)胞類型分類的單細(xì)胞圖譜。 e.?? 按疾病分類的單細(xì)胞圖。 f.?? 點(diǎn)圖顯示按細(xì)胞類型分類的MrDEGs。 g.?? 由MrDEGs著色的UMAP圖。

（4）驗(yàn)證MrDEG DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄組水平

研究通過TBS技術(shù)對NEC患者和對照組的回腸組織樣本進(jìn)行甲基化水平檢測，檢測結(jié)果揭示ADAP1、GUCA2A、IL22RA1、MISP、UNC93A和USH1C基因在NEC組織中的甲基化水平顯著升高。RT-qPCR結(jié)果表明，這些基因在NEC組織中的RNA表達(dá)水平顯著降低。這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因在NEC中的甲基化調(diào)控作用。

圖4：在人組織樣本中驗(yàn)證甲基化相關(guān)差異基因（MrDEGs）的甲基化水平和RNA表達(dá)。 a.????? MrDEGs甲基化水平可視化。熱圖顯示CpG島的甲基化水平，右側(cè)指示該CpG島測序的起始位置。 b.???? 顯示MrDEGs甲基化水平差異直方圖。 c.????? NEC患者中甲基化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。

（5）MrDEG 功能預(yù)測

通過單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析結(jié)果揭示了ADAP1、GUCA2A、IL22RA1和MISP主要在腸道上皮細(xì)胞的腸絨毛細(xì)胞中表達(dá)。HE染色結(jié)果顯示，NEC組織的腸絨毛結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損。通過GSEA分析揭示這些基因的低表達(dá)與TNF信號通路、NF-κB信號通路、IL-17信號通路和Toll樣受體信號通路的過度激活有關(guān)。這些通路過度激活可能導(dǎo)致腸道細(xì)胞炎癥反應(yīng)加劇，從而加重NEC病理過程。

圖5：通過單細(xì)胞數(shù)據(jù)和單基因GSEA分析預(yù)測MrDEGs定位和作用。 a.????? 按細(xì)胞類型分類的腸上皮細(xì)胞簇的重新聚類圖譜。 b.???? 按疾病分類的腸上皮細(xì)胞簇的重新聚類圖譜。 c.????? 由MrDEGs著色的UMAP圖。 d.???? H&E染色實(shí)驗(yàn)分析NEC組和對照組腸絨毛結(jié)構(gòu)的病理變化， e-h. MrDEGs組中的免疫相關(guān)基因集。

討論和啟示

本研究通過多組學(xué)分析，揭示了NEC中DNA甲基化的調(diào)控機(jī)制，并鑒定出多個潛在的甲基化調(diào)控生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物在NEC的早期診斷和精準(zhǔn)醫(yī)療中具有重要的應(yīng)用前景。此外，研究還探討了這些生物標(biāo)志物在NEC病理過程中的作用機(jī)制，為未來開發(fā)新的治療策略提供了理論基礎(chǔ)。未來的研究需要在更大的臨床樣本中驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，并進(jìn)一步探索這些生物標(biāo)志物在NEC發(fā)病機(jī)制中的具體作用。

圖6：甲基化相關(guān)差異基因（MrDEGs）篩選過程及其作用機(jī)制示意圖。

靶基因甲基化測序分析（TBS）在本研究中發(fā)揮了重要作用。TBS技術(shù)通過檢測靶基因甲基化水平，為研究NEC中的DNA甲基化調(diào)控機(jī)制提供了直接證據(jù)。TBS技術(shù)的單堿基分辨率和高靈敏度使其能夠準(zhǔn)確檢測到NEC組織中基因啟動子區(qū)域的甲基化變化，從而揭示了這些基因在NEC中的潛在調(diào)控作用。未來類似標(biāo)志物篩選驗(yàn)證研究中，TBS技術(shù)可以作為一種重要的工具，用于驗(yàn)證和篩選潛在的甲基化調(diào)控生物標(biāo)志物，為疾病的早期診斷和治療提供新思路。

參考文獻(xiàn)：

Tian B, Xu X, Li L, Tian Y, Liu Y, Mu Y, Lu J, Song K, Lv J, He Q,Zhong W, Xia H, Lan C. Epigenetic Insights Into Necrotizing Enterocolitis:Unraveling Methylation-Regulated Biomarkers. Inflammation. 2024 May 30. doi:10.1007/s10753-024-02054-x.